呂科旻，周雨朦，吳 斌，何冰芳

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2. 南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 222062；3. 南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800 )

纖維素是地球上含量最豐富的可再生資源，因其具有替代生物燃料和化學(xué)工業(yè)中化石燃料的潛力，受到人們的廣泛關(guān)注[1]。由于天然纖維素的結(jié)構(gòu)和組織十分復(fù)雜堅固，通常需要至少3種酶的協(xié)同作用，包括內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，隨機(jī)地水解纖維素的非結(jié)晶部分并切斷β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生不同聚合度的纖維寡糖和新的游離末端；外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91),作用于纖維素鏈的還原端和非還原端并不斷降解產(chǎn)生纖維二糖產(chǎn)物；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21),將纖維二糖和寡糖最終水解為可溶性葡萄糖[2]。因此，酶混合物的高成本和低水解效率一直是纖維素轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的主要障礙[3]。

近年來，人們不斷地從纖維素降解菌中發(fā)現(xiàn)具有雙催化功能的纖維素酶，這類酶被稱為持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶，因?yàn)檫@類酶同時具有內(nèi)切酶和外切酶活性，與β-葡萄糖苷酶的相互協(xié)同作用可以更加高效地水解纖維素[4]。迄今為止，文獻(xiàn)報道的持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶主要屬于GH5和GH9家族的糖苷水解酶[4]。GH9家族的持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶主要來自梭菌屬，如熱線梭菌(Clostridiumthermocellum)[5]、解纖維梭菌(C.cellulolyticum)[6]、植物梭狀芽孢桿菌(C.phytofermentans)[7]等，該家族的酶通常由催化結(jié)構(gòu)域(GH)和一個或者多個碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)組成。而GH5家族的持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶有來源廣泛及組成結(jié)構(gòu)多樣的特點(diǎn)，如：來源于草菇(Volvariellavolvacea)的纖維素酶EG1在C端含有1個GH5催化結(jié)構(gòu)域和在N端還包含1個CBM1的碳水化合物結(jié)合模塊，并且CBM1的缺失直接影響酶的持續(xù)性[8]；而來源于Saccharophagusdegradans2-40的持續(xù)性內(nèi)切酶CeI5H，其碳水化合物結(jié)合模塊CBM6的缺失并不影響酶原有的催化特性[4]。雖然持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶廣泛受到人們的關(guān)注，但是目前許多研究主要集中于不同碳水化合物結(jié)合模塊對于酶持續(xù)性的機(jī)制方面，而在提高持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶的催化活性方面的研究報道很少[9]。

筆者所在課題組在前期的研究中從BacillussubtilisBS-5中篩選得到一個持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶EG5C-1，因此擬通過建立該酶的同源模型和使用分子對接的方法，基于酶活性架構(gòu)的分析篩選得到23個關(guān)鍵氨基酸殘基，利用丙氨酸掃描、飽和突變及組合突變等方法篩選酶催化特性最優(yōu)的突變體并對其酶學(xué)性質(zhì)和水解產(chǎn)物進(jìn)行研究分析，為持續(xù)性內(nèi)切酶催化活性的進(jìn)一步提高提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

重組菌EG5C-1、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，均保存于何冰芳教授實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

NaCl、胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂，生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；Phanta高保真酶、DNA marker、DpnⅠ、蛋白Marker，TaKaRa公司；纖維寡糖標(biāo)品，Megazyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0、酵母粉 5.0、胰蛋白胨 10.0。固體培養(yǎng)基中另加瓊脂 20.0。

LB卡那固體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0、酵母粉 5.0、胰蛋白胨 10.0、瓊脂 20.0。滅菌冷卻后加入過濾無菌的硫酸卡那霉素(Kan)，使其終質(zhì)量濃度為50 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1 同源建模與突變點(diǎn)的選擇

以來源于B.subtilis168的纖維素酶BsCel5A催化模塊的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:3PZT)為模板，使用BIOVIA公司的Discovery Studio(DS 3.5)軟件構(gòu)建原始酶EG5C-1的三維結(jié)構(gòu)[10-11]。從來源于短小芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶GH48的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:5CVY)中提取纖維六糖結(jié)構(gòu)，并使用Chemical Computing Group (CCG)公司的MOE2019.01軟件進(jìn)行分子對接，將其對接至原始酶EG5C-1的活性中心架構(gòu)中。根據(jù)對接的自由結(jié)合能，選擇纖維六糖周圍0.5 nm以內(nèi)的氨基酸作為丙氨酸突變的位點(diǎn)[12]。

1.2.2 突變體文庫的構(gòu)建

使用Overlap PCR方法[13]進(jìn)行定點(diǎn)突變。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)獲得的持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶EG5C-1的基因序列和目的突變位點(diǎn)設(shè)計相應(yīng)的引物。以原始酶EG5C-1質(zhì)粒為模板，Phanta高保真酶進(jìn)行全質(zhì)粒擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)3 min使DNA預(yù)變性；95 ℃變性反應(yīng)15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸反應(yīng)8 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用DpnⅠ酶，于37 ℃恒溫消化30 min，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證后導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中。挑取平板的單菌落并送至南京擎科生物科技公司進(jìn)行序列比對，將正確突變的單菌落接種于終質(zhì)量濃度為150 g/L的甘油中，于-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.3 突變體酶的表達(dá)與純化

將突變體接種于含Kan抗性的LB種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將種子培養(yǎng)基接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，25 ℃、180 r/min搖床誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液離心，收集菌體并用適當(dāng)?shù)腘a2HPO4-KH2PO4緩沖(pH 6.5)重懸，超聲破碎菌體，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液即為粗酶液。粗酶液使用HisTrap FF色譜柱(GE Healthcare)通過親和色譜法進(jìn)行純化，純化方法見參照文獻(xiàn)[14]，取純化酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并測定酶活。

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度測定

取適當(dāng)稀釋的純化酶液，使用Bradfoard法[15]測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 酶活測定

酶活力單位定義：一個酶活力單位即為在最適反應(yīng)條件下，每分鐘由底物產(chǎn)1 mmol還原糖所需的酶量。

1)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)酶活。取0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5 mL的CMC-Na(10 g/L)底物于60 ℃條件下反應(yīng)10 min，立即加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min后，使用紫外分光光度計在540 nm處測定吸光度值A(chǔ)450，計算還原糖的生成量。

2)微晶纖維素(Avicel)酶活。取0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5 mL的Avicel(100 g/L)底物于60 ℃條件下反應(yīng)30 min，立即置于冰上冷卻，12 000 r/min離心取上清液，加入3 mL的DNS溶液，沸水浴5 min后，使用紫外分光光度計在540 nm處測定吸光度值A(chǔ)450，計算還原糖的生成量。

1.2.6 突變體酶學(xué)性質(zhì)分析

1)最適溫度和溫度穩(wěn)定性。取0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5 mL的CMC-Na(10 g/L) 底物在30、40、50、60、70、80和90 ℃條件下反應(yīng)10 min后測定其相應(yīng)的酶活。以最高的酶活為對照，依次計算相對酶活，分析溫度對酶活的影響。將適當(dāng)稀釋的酶液在30、40、50、60、70、80和90 ℃條件下孵育2 h后，測定其相應(yīng)的酶活。以最高的酶活為對照，依次計算相對酶活，分析溫度對酶穩(wěn)定性的影響。

2)最適pH和pH穩(wěn)定性。用檸檬酸-檸檬酸鈉(pH 3.0～6.0)、Na2HPO4-KH2PO4(pH 6.0～8.0)、Gly-NaOH(pH 8.0～9.0)配制10 g/L不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的羧甲基纖維素鈉，吸取1.5 mL作為底物，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，于60 ℃條件下反應(yīng)10 min后，測定其相應(yīng)的酶活。以最高的酶活為對照，依次計算相對酶活，分析pH對酶活的影響。將適當(dāng)稀釋的酶液分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下孵育2 h后，測定其相應(yīng)的酶活。以最高的酶活為對照，依次計算相對酶活，分析pH對酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.7 突變體酶水解產(chǎn)物分析

選擇CMC-Na、Avicel、磷酸處理的微晶纖維素(PASC)為底物，突變體酶與底物于45 ℃下混合反應(yīng)6 h，將酶反應(yīng)混合物沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用薄層層析法(TLC)[14]分析酶水解產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的確定

將EG5C-1的同源模型與底物配體分子進(jìn)行分子對接分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：EG5C-1的活性架構(gòu)是由8個平行的β鏈和8個α螺旋形成的一個開放式裂隙，該裂隙長約3.1 nm，可以容納6個葡萄糖基單元。通常情況下，底物結(jié)合亞位點(diǎn)從-3到+3分布，其中-n端為非還原段，+n端為還原端，而產(chǎn)物的裂解發(fā)生在-1和+1位之間[12]。使用自動對接程序AutoDock 4.2將纖維六糖對接至活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)中，分析酶與底物間起關(guān)鍵作用的氨基酸，對接結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：共有23個氨基酸殘基，包括H36、W40、Y67、D70、H102、L104、N105、E140、T177、W178、Q180、D181、Y202、T205、H206、F209、K213、E228、A234、S235、W262、K267和E269與對接的纖維六糖分子距離在0.5 nm以內(nèi)，其中，E140位于β鏈Ⅳ上作為質(zhì)子供體，E228位于β鏈Ⅶ上作為催化親核基團(tuán)，由于這2個氨基酸處于EG5C-1的活性中心，將它們突變會直接導(dǎo)致酶完全喪失活性。因此，選擇其余的20個氨基酸殘基(A234除外)作為突變研究的目標(biāo)氨基酸。

圖1 EG5C-1與纖維六糖活性中心對接的卡通樣式和表面形式Fig.1 Structures of the active site of EG5C-1 complexed with a cellohexaose molecular carton representation and surface representation

圖2 纖維六糖分子對接至持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶的催化裂隙中Fig.2 Modeled structure of the processive endoglucanase EG5C-1 with a docked cellohexaose bound to the catalytic cleft

2.2 丙氨酸突變結(jié)果

以原始酶EG5C-1質(zhì)粒pET-28a/EG5C-1為模板，通過PCR擴(kuò)增，完成相應(yīng)的突變H36A、W40A、Y67A、H102A、L104A、N105A、T177A、W178A、Q180A、D181A、Y202A、T205A、H206A、F209A、K213A、S235A、W262A、K267A和E269A(A234除外)。通過測序和序列比對確定突變位點(diǎn)與設(shè)計的目標(biāo)位點(diǎn)一致。

圖3 EG5C-1的丙氨酸突變體對CMC和Avicel相對的水解酶活Fig.3 Relative hydrolytic activities of alanine-substituted mutants of EG5C-1 against CMC and Avicel

將丙氨酸突變體進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)后，以羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素為底物測定其相應(yīng)的酶活，結(jié)果如圖3。由圖3可知：總體而言，大多數(shù)突變體對于CMC和Avicel底物的活性均顯著下降，其中，芳香族氨基酸和極性氨基酸殘基的突變尤其顯著，如W40A、Y67A和W178A，當(dāng)它們突變?yōu)楸彼岷?，其突變體對于2種底物幾乎都失去了相應(yīng)的活性。而突變體D70A與原始酶相比，其對于CMC底物的酶活提高了1.15倍；突變體S235A對于CMC和Avicel的酶活分別提高了約1.20倍和1.10倍。此外，突變體T177A仍具有與原始酶相似的酶活。為了探究D70、T177和S235位點(diǎn)上被其他氨基酸殘基取代對酶活的影響，選擇這3個位點(diǎn)與A234一同進(jìn)行飽和突變。

2.3 飽和突變結(jié)果

分別使用在飽和突變位點(diǎn)D70、T177、A234和S235含簡并堿基NNN的引物隨機(jī)突變成任意氨基酸，通過測序和序列比對確定突變位點(diǎn)與特定氨基酸密碼子一致。將飽和突變體進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)后，以羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素為底物測定其相應(yīng)的酶活，結(jié)果如圖4。由圖4可知：將谷氨酰(D)置換為天冬氨酸(Q)對酶的活性影響最大，與原始酶相比，其對于CMC和Avicel的比酶活分別提高了1.5倍和1.3倍。同樣，在S235飽和突變中，最優(yōu)突變體對于CMC和Avicel 的比活性分別提高了1.4倍和1.2倍。然而，T177和A234位點(diǎn)的飽和突變體的酶活均沒有顯著的提升。

2.4 組合突變結(jié)果

將D70和S235飽和突變中的最優(yōu)突變體進(jìn)行組合突變，得到突變體D70Q/S235W，經(jīng)發(fā)酵表達(dá)后，以羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素為底物測定其相應(yīng)的酶活，結(jié)果如圖5。由圖5可知：與兩個單一的突變體D70Q和S235W相比，組合突變體D70Q/S235W的酶活都有所提高，而與原始酶EG5C-1相比，D70Q/S235W對于CMC和Avicel的酶活分別提高了2.1倍和1.7倍，提高效果顯著。

圖4 D70、T177、A234和S235的飽和突變與原始酶EG5C-1對CMC和Avicel相對的水解酶活Fig.4 Relative hydrolytic activities of wild-type EG5C-1 and variants obtained through saturation mutagenesis of residues D70, T177, S234, and S235 against CMC and Avicel

圖5 組合突變體D70Q/S235W對CMC和Avicel相對的水解酶活Fig.5 Relative hydrolytic activities of combined mutants of D70Q/S235W against CMC and Avicel

2.5 D70Q/S235W酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 D70Q/S235W的最適溫度及熱穩(wěn)定性

以CMC作為底物測定不同溫度下酶活的變化，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：原始酶EG5C-1的最適溫度為60 ℃，而所有突變體D70Q、S235W和D70Q/S235W均顯示出與EG5C-1相似的最適溫度。當(dāng)溫度為30～60 ℃時，原始酶及突變體的酶活逐漸升高；當(dāng)溫度高于60 ℃時，原始酶及突變體的酶活顯著下降。

圖6 原始酶EG5C-1及其突變體酶的最適反應(yīng)溫度Fig.6 Optimum temperature of the wild type EG5C-1 and its variants

酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖7。由圖7可知：原始酶EG5C-1在50 ℃下保溫2 h后，仍然保留了80%以上的酶活，而所有突變體D70Q、S235W、D70Q/S235W均顯示出與EG5C-1相似的溫度穩(wěn)定性。原始酶EG5C-1在60 ℃下保溫2 h后，酶活保留了約70%左右，而突變體中D70Q/S235W仍然保留了80%的酶活，表明突變體酶的溫度穩(wěn)定性相比于原始酶有所提高，這對于工業(yè)生產(chǎn)具有很大的幫助。

圖7 原始酶EG5C-1及其突變體酶的溫度穩(wěn)定性Fig.7 Thermal-stability of the wild type EG5C-1 and its variants

2.5.2 D70Q/S235W的最適pH及pH穩(wěn)定性

以CMC作為底物測定不同pH下酶活力的變化，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：原始酶EG5C-1與所有突變體D70Q、S235W、D70Q/S235W的最適pH均為6.0，隨著pH的逐漸升高，酶活逐漸降低，表明EG5C-1與突變體酶都是偏酸性的酶。

圖8 原始酶EG5C-1及其突變體酶的最適反應(yīng)pHFig.8 Optimum pH of the wild type EG5C-1 and its variants

圖9為原始酶EG5C-1及其突變體酶的pH穩(wěn)定性。由圖9可知：原始酶EG5C-1與突變體酶在pH 為5.0～ 9.0時的穩(wěn)定性較好，孵育2 h后仍然保留了70%以上的酶活，而當(dāng)pH為3.0～5.0時，原始和突變體酶的穩(wěn)定性都較低，表明該酶不適于保存在強(qiáng)酸的條件下。同時，在不同pH條件下，原始酶EG5C-1 保留的酶活相比于其他所有突變體都較低，表明突變體的pH穩(wěn)定性得到了提高。

圖9 原始酶EG5C-1及其突變體酶的pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of the wild type EG5C-1 and its variants

2.6 D70Q/S235W水解產(chǎn)物分析

以CMC、Avicel和PASC為底物，用TLC分析雙突變體D70Q/S235W的水解作用模式，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：突變體D70Q/S235W對于不同的底物都具有很好的水解效果，且對于每一種底物的最終產(chǎn)物都主要為纖維二糖和纖維三糖；雙突變體對于可溶性底物CMC和不溶性底物Avicel、PASC的水解作用模式與原始酶EG5C-1的作用模式相似[14]，表明D70和S235位點(diǎn)上氨基酸殘基的改變沒有對產(chǎn)物的釋放造成影響。

M為標(biāo)準(zhǔn)糖；G1—葡萄糖；G2—纖維二糖；G3—纖維三糖；G4—纖維四糖；1、4、7—對照；2、5、8—EG5C-1水解CMC、Avicel和PASC的產(chǎn)物；3、6、9—D70Q/S235W水解CMC、Avicel和PASC的產(chǎn)物圖10 EG5C-1和突變體D70Q/S235W對不同纖維素基質(zhì)的水解產(chǎn)物的薄層色譜分析Fig.10 TLC analysis of the hydrolysis products from various cellulosic substrates by EG5C-1 and mutant D70Q/S235W

3 結(jié)論

纖維素酶作為一種重要的工業(yè)催化劑，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，然而由于纖維素復(fù)雜的組成結(jié)構(gòu)，往往天然的單一纖維素酶催化效率很低。本文通過同源建模和分子對接對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，確定了持續(xù)性內(nèi)切葡聚糖酶EG5C-1活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，并使用定點(diǎn)突變和飽和突變等方法設(shè)計得到了具有較高催化活性的突變體D70Q/S235W。

組合突變體D70Q/S235W在60 ℃和pH 6.0時表現(xiàn)出與原始酶EG5C-1相似的最適溫度和最適pH，且與原始酶相比，組合突變體具有更好的溫度和pH穩(wěn)定性，為進(jìn)一步研究和開發(fā)工業(yè)用酶奠定了基礎(chǔ)。