李 黎，潘 慧，李文藝，韓 飛，胡光明，張 琦，鐘彩虹

(1.中國(guó)科學(xué)院 植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074;2.中國(guó)科學(xué)院 獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，武漢 430073;3.中國(guó)科學(xué)院 種子創(chuàng)新研究院，武漢 430022;4.中國(guó)科學(xué)院 武漢植物園，武漢 430074)

獼猴桃富含多種維生素和礦質(zhì)元素，被譽(yù)為“水果之王”，是20世紀(jì)野生果樹成功馴化栽培的典范.中國(guó)是獼猴桃屬植物的原產(chǎn)地和栽培品種的發(fā)源地，目前種植面積已超越意大利、新西蘭及伊朗等各國(guó)的種植面積總和，2020年產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的68%，成為世界最大的獼猴桃生產(chǎn)國(guó)[1].目前，我國(guó)獼猴桃商業(yè)化栽培以中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis)及美味獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)為主.其中，中華獼猴桃因其果面光滑，品質(zhì)及口感尤佳，近年來逐漸受到消費(fèi)者喜愛[2].

2010年以來，由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種[Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)]引起的細(xì)菌性潰瘍病在我國(guó)各獼猴桃主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)，平均病株率超過40%，死樹、毀園情況頻發(fā)，累計(jì)感病面積超過十萬公頃，給我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失.潰瘍病主要癥狀發(fā)生在早春，植株主干和枝條龜裂，病部皮層水漬狀軟腐，早期伴有乳白色黏質(zhì)菌膿，傷流期轉(zhuǎn)為黃褐色或銹紅色菌膿.隨后，葉片上出現(xiàn)伴有黃色暈圈的不規(guī)則形褐色斑點(diǎn)，葉片焦枯卷曲、枯稍，花蕾變褐枯死并脫落.最后，隨病情加重，影響?zhàn)B分輸送吸收，樹勢(shì)逐漸衰弱直至樹體死亡[3].多項(xiàng)研究證實(shí)中華獼猴桃品種的潰瘍病抗性整體較差，‘紅陽’‘早鮮’‘金豐’‘云海1號(hào)’‘楚紅’及‘Hort16A’等均被鑒定為高感品種[4-5].

盡快研究并解決潰瘍病對(duì)產(chǎn)業(yè)威脅的問題已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外獼猴桃研究的首要命題.生產(chǎn)實(shí)踐證明，相對(duì)于栽培措施和化學(xué)藥劑防治，利用抗病品種防治是最為理想的病害控制途徑.中國(guó)野生獼猴桃資源種類、儲(chǔ)量及遺傳多樣性均非常豐富，野生資源歷經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇，可能含有高抗種質(zhì)，可作為獼猴桃抗病基因改良的重要材料[6].因此，對(duì)中華獼猴桃野生種質(zhì)進(jìn)行潰瘍病抗性評(píng)價(jià)迫在眉睫.國(guó)內(nèi)前期研究主要針對(duì)已有品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，僅張敏等[7]對(duì)貴州產(chǎn)區(qū)黃肉獼猴桃品種的4株優(yōu)系進(jìn)行了潰瘍病抗性評(píng)價(jià).本研究利用離體枝條人工病菌接種方法，對(duì)在國(guó)家獼猴桃種質(zhì)資源圃收集自7個(gè)省份的129份中華獼猴桃野生種質(zhì)進(jìn)行了全面的潰瘍病抗性鑒定及評(píng)價(jià)，篩選抗性種質(zhì)資源，為后續(xù)進(jìn)行抗病選育及抗性機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 潰瘍病菌株 采集自我國(guó)湖南省常德市東山峰農(nóng)場(chǎng)(中國(guó)獼猴桃潰瘍病最早感病園區(qū)，東經(jīng)110°41′42.36″，北緯29°55′1.56″)的C48菌株，經(jīng)生物學(xué)特性及全基因組SNP分型鑒定，確定為目前全球流行的Psa3型強(qiáng)致病力菌株[8].

1.1.2 待鑒定的獼猴桃種質(zhì) 129份中華獼猴桃野生種質(zhì)均由國(guó)家獼猴桃種質(zhì)資源圃收集，其中72份來自安徽、36份來自四川、11份來自湖南、7份來自浙江、1份來自湖北、1份來自江西、1份來自江蘇，具體收集時(shí)間及地點(diǎn)如表1所示，收集后翌年2月嫁接，目前均保存在國(guó)家獼猴桃種質(zhì)資源圃主圃內(nèi)(中國(guó)科學(xué)院武漢植物園獼猴桃園).已報(bào)道的2個(gè)國(guó)內(nèi)主栽品種潰瘍病高感中華獼猴桃品種‘紅陽’及耐病美味獼猴桃品種‘徐香’設(shè)置為對(duì)照[5]，均栽培在國(guó)家獼猴桃種質(zhì)資源圃主圃內(nèi).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞染色體倍性測(cè)定 采用Cy-Flow Space 流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)對(duì)新鮮幼嫩葉片進(jìn)行倍性測(cè)定[9]，將二倍體中華品種‘紅陽’(2n=2x=58)設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品.取小塊葉片置于含1 mL細(xì)胞裂解液(混和1% PVP溶液)的培養(yǎng)皿中并用刀片迅速切碎，裂解30 s后加入1 mL 5 μg/mL的DAPI染色液進(jìn)行細(xì)胞核DNA染色標(biāo)記，放置30 s后用400目濾膜過濾，收集濾液于EP(eppendorf)管，上樣后記錄結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品出峰的相對(duì)熒光強(qiáng)度設(shè)置為50，待測(cè)樣本的倍性記錄=參照樣本的倍性值×(待測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度值/參照樣本的熒光強(qiáng)度值).實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示.

圖1 實(shí)驗(yàn)過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental process

(a)高抗種質(zhì)‘HB 3021’;(b) 中抗種質(zhì)‘JX B2755’;(c) 低抗種質(zhì)‘SC B2585’;(d) 耐病種質(zhì)‘HN B2324’;(e) 低感種質(zhì)‘AN B3211’;(f) 中感種質(zhì)‘AN B3343’;(g) 高感種質(zhì)‘AN B2982’.圖2 7個(gè)抗性等級(jí)代表性種質(zhì)的病斑癥狀Fig.2 Diseaselesion symptoms of representative germplasm of seven resistance categories

1.2.2 菌株活化及培養(yǎng) 活化培養(yǎng)C48菌株，挑取單菌落加入1 mL液體KB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，8 000 r/min離心5 min，取沉淀，用無菌水將病菌懸浮液稀釋109cfu/mL.

1.2.3 采用離體枝條進(jìn)行接種 ① 枝條采集：對(duì)每份待鑒定種質(zhì)，于獼猴桃落葉休眠期(11-12月)采集直徑約為0.8 cm的1年生健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的木質(zhì)化枝條，剪成10 cm一段的小枝條，用封口膜封住枝條的兩端，減少水分流失，并按株號(hào)做好標(biāo)記.每種種質(zhì)設(shè)置6個(gè)重復(fù).② 枝條接菌：用5%乙醇對(duì)每根枝條進(jìn)行表面消毒，無菌水清洗2遍，晾干.隨后，用無菌刀片在枝條上等間隔切割傷口，切口寬2 mm，深至韌皮部，切口上各滴10 μL的菌液.③ 枝條培養(yǎng)：待菌液滲透進(jìn)枝條傷口后，將傷口朝上放置在底部鋪有濕濾紙的托盤中，再用薄膜覆蓋枝條保濕，托盤內(nèi)濕度保持在80%左右，置于16 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)27 d.④ 病斑測(cè)量：枝條培養(yǎng)27 d時(shí)用無菌刀削去枝條皮層，測(cè)量病菌侵染后在枝條上造成的褐色病斑長(zhǎng)度.

1.2.4 抗性等級(jí)評(píng)價(jià) 基于枝條病斑長(zhǎng)度對(duì)種質(zhì)進(jìn)行抗性等級(jí)劃分,相較于裴艷剛[4]及王發(fā)明等[10]的方法，對(duì)抗性等級(jí)進(jìn)行了更詳細(xì)的劃分.① 高抗(high resistant,HR)：病斑長(zhǎng)度≤3.0 cm；② 中抗(moderate resistant,MR)：3.0 cm<病斑長(zhǎng)度≤4.0 cm；③ 低抗(low resistant,LR)：4.0 cm<病斑長(zhǎng)度≤5.0 cm；④ 耐病(tolerant,T)：5.0 cm<病斑長(zhǎng)度≤6.0 cm；⑤ 低感(low susceptible,LS)：6.0 cm<病斑長(zhǎng)度≤7.0 cm；⑥ 中感(moderate susceptible,MS)：7.0 cm<病斑長(zhǎng)度≤8.0 cm；⑦ 高感(high susceptible,HS)：病斑長(zhǎng)度>8.0 cm.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素(one-way ANOVA)Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 潰瘍病抗性鑒定結(jié)果

基于枝條病斑長(zhǎng)度分析‘紅陽’及‘徐香’對(duì)照品種的抗病等級(jí)，證實(shí)‘紅陽’屬于高感等級(jí)，‘徐香’屬于耐病等級(jí).將129份中華獼猴桃野生種質(zhì)劃分為7個(gè)抗性等級(jí),如圖2和表1所示，發(fā)現(xiàn)其中含高抗種質(zhì)1份——二倍體種質(zhì)‘湖北3021’(占比0.77%)，中抗種質(zhì)1份——二倍體種質(zhì)‘江西B2755’(占比0.77%)，低抗種質(zhì)3份——四倍體種質(zhì)‘四川B2585’、二倍體種質(zhì)‘湖南B2243’及‘湖南B2244’(占比2.33%)，耐病種質(zhì)5份(占比3.88%)，低感種質(zhì)25份(占比19.38%)，中感種質(zhì)15份(占比11.63%)及高感種質(zhì)79份(占比61.24%).由此可見，中華獼猴桃野生種質(zhì)整體抗性較差，抗性種質(zhì)比例僅為3.87%，耐病種質(zhì)比例為3.88%，感病種質(zhì)比例高達(dá)92.25%,如圖3(a)所示.

2.2 潰瘍病抗性與地域之間的關(guān)系

基于采集區(qū)域進(jìn)行抗性分析，發(fā)現(xiàn)安徽省及四川省樣本數(shù)目相對(duì)較多，可用于分析抗性材料比例；其中安徽省收集的72份種質(zhì)中不含抗病種質(zhì)，含耐病種質(zhì)3份(占比4.17%)，低感種質(zhì)15份(占比20.83%)，中感種質(zhì)11份(占比15.28%)，高感種質(zhì)43份(占比59.72%)，所圖3(b)所示.四川省收集的36份種質(zhì)中含低抗種質(zhì)1份——四倍體低抗種質(zhì)‘四川B2585’(占比2.78%)，低感種質(zhì)8份(占比22.22%)，中感種質(zhì)3份(占比8.33%)，高感種質(zhì)24份(占比66.67%)，如圖3(c)所示.綜合分析發(fā)現(xiàn)安徽省及四川省中華獼猴桃野生種質(zhì)中抗病種質(zhì)的比例均較低，感病種質(zhì)比例均高于95%，其中四川省抗病種質(zhì)比例略高于安徽省.湖南、浙江、湖北、江西及江蘇等省份的樣本數(shù)目較少，暫未進(jìn)行抗性與地域間的關(guān)聯(lián)分析.

表1 129份中華獼猴桃野生種質(zhì)的病斑長(zhǎng)度及抗性等級(jí)分析Tab.1 Disease lesion length and resistance categories analysis of 129 wild A.chinensis var.chinensis germplasm resources

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 潰瘍病抗性與倍性之間的關(guān)系

從染色體倍性角度而言，129份種質(zhì)中含二倍體材料94份，其中高抗二倍體種質(zhì)‘湖北3021’1份，中抗二倍體種質(zhì)‘江西B2755’1份，低抗二倍體種質(zhì)‘湖南B2243’及‘湖南B2244’2份，耐病種質(zhì)3份，低感種質(zhì)18份，中感種質(zhì)11份，高感種質(zhì)58份；對(duì)應(yīng)抗性種質(zhì)比例為4.26%，耐病種質(zhì)比例為3.19%，感病比例為92.55%，如圖3(d)所示.四倍體種質(zhì)35份，其中低抗四倍體種質(zhì)‘四川B2585’1份，耐病種質(zhì)2份，低感種質(zhì)7份，中感種質(zhì)4份，高感種質(zhì)21份；對(duì)應(yīng)抗性種質(zhì)比例為2.86%，耐病種質(zhì)比例為5.71%，感病比例為91.43%，如圖3(e)所示.篩選得到的5份抗病種質(zhì)中‘四川B2585’為四倍體種質(zhì)，‘湖北3021’‘江西B2755’‘湖南B2243’及‘湖南B2244’均為二倍體種質(zhì).由于四倍體種質(zhì)數(shù)目較少，未篩選到高抗及中抗種質(zhì)，因此無法橫向比較四倍體種質(zhì)和二倍體種質(zhì)的抗病性.

圖3 129份種質(zhì)整體抗性分析及按照地域、倍性單獨(dú)分析Fig.3 Overall resistance analysis of 129 germplasms and the individual analysis accordng to region and ploidy

3 討論

近年來，運(yùn)用離體木質(zhì)化枝條接種潰瘍病菌，觀察病斑長(zhǎng)度以鑒定獼猴桃種質(zhì)抗性的方法逐步得到應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)枝條病斑長(zhǎng)度及組織菌量濃度、田間感病情況之間呈顯著正相關(guān)性，不同年份離體枝條接種的感病情況基本一致并達(dá)到極顯著相關(guān)水平[11-12].石志軍等[5]及強(qiáng)遙[13]分別基于離體枝條病斑長(zhǎng)度對(duì)24及23個(gè)獼猴桃品種的潰瘍病抗性進(jìn)行了分級(jí)，證實(shí)‘徐香’的抗性明顯優(yōu)于‘紅陽’.本研究基于相同分析方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，以中華品種‘紅陽’及美味品種‘徐香’為對(duì)照，對(duì)收集自7個(gè)省份的129份中華獼猴桃野生種質(zhì)的潰瘍病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià).研究結(jié)果表明‘紅陽’及‘徐香’分別被鑒定為高感及耐病品種，證實(shí)了運(yùn)用離體枝條實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大規(guī)模中華獼猴桃野生種質(zhì)抗性評(píng)價(jià)的可靠性.

無論從整體抗性、采集地域或倍性角度分析，本研究結(jié)果均顯示中華獼猴桃野生種質(zhì)中的抗病種質(zhì)比例低于4%，整體抗性較差，但同時(shí)證實(shí)野生中華獼猴桃中仍含有抗病種質(zhì).被鑒定為高抗?jié)儾〉亩扼w種質(zhì)‘湖北3021’采集自湖北省孝感市山區(qū)，果實(shí)較小、長(zhǎng)梭形，果面被極短茸毛，果肉黃色、肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味甜酸適宜，成熟早，適合作為育種親本材料.其他4份抗性材料經(jīng)馴化保存，今年剛進(jìn)入結(jié)果期，暫未得到果實(shí)品質(zhì)鑒定結(jié)果，但樹勢(shì)均較強(qiáng)旺.特別關(guān)注的是從湖南收集的11份野生種質(zhì)中，鑒定到了2份低抗種質(zhì)、1份耐病種質(zhì)，分別占比18.18%和9.09%，結(jié)合早期從湖南野生資源中培育的中抗品種‘翠玉’[6]和低抗品種‘湘麻6號(hào)’(按照本文評(píng)價(jià)方法，湖南省園藝所早期從麻陽縣西晃山采集野生種質(zhì)并馴化選育的四倍體品種‘湘麻6號(hào)’被鑒定為低抗等級(jí))，證實(shí)在野外資源中篩選抗病種質(zhì)作育種親本或直接馴化成為優(yōu)異品種是可行的.此外，仲偉敏等[14]對(duì)貴州黔東南地區(qū)收集到的1份黃肉野生獼猴桃單株進(jìn)行洗種播種，監(jiān)測(cè)了其198份黃肉野生獼猴桃實(shí)生株系的田間潰瘍病抗性，發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗后代的潰瘍病抗性差異明顯，初步篩選出4株具有優(yōu)良抗性且風(fēng)味品質(zhì)較好的雌株實(shí)生苗，證實(shí)利用中華獼猴桃野生種質(zhì)進(jìn)行實(shí)生選育篩選獲得優(yōu)質(zhì)抗性品種這一方向也是可行的.

近年來，基于生理、生化、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝數(shù)據(jù)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究系統(tǒng)分析了中華獼猴桃抗性較差的原因，發(fā)現(xiàn)與軟棗獼猴桃、毛花獼猴桃等中抗性品種及美味獼猴桃中的‘布魯諾’‘徐香’等耐病品種相比，中華獼猴桃易感品種‘紅陽’及‘楚紅’等品種的組織結(jié)構(gòu)、酚類物質(zhì)、可溶性蛋白及糖含量、防御性酶活表達(dá)及抗病相關(guān)防御基因的表達(dá)機(jī)制等方面均存在明顯差異[15-23].然而，迄今為止國(guó)內(nèi)外仍未找到關(guān)鍵的獼猴桃潰瘍病抗病基因，無法開發(fā)高效的抗性標(biāo)記用于中華獼猴桃種質(zhì)資源的大規(guī)?？剐栽u(píng)價(jià)或精準(zhǔn)抗病育種.

本研究結(jié)果表明，雖然中華獼猴桃野生種質(zhì)的整體潰瘍病抗性較差，但仍有希望篩選到抗病種質(zhì).針對(duì)本研究篩選到的5份野生抗病種質(zhì)，二倍體高抗種質(zhì)‘湖北3021’、二倍體中抗種質(zhì)‘江西B2755’、四倍體低抗種質(zhì)‘四川B2585’、二倍體低抗種質(zhì)‘湖南B2243’及‘湖南B2244’，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行綜合鑒定，對(duì)優(yōu)異種質(zhì)直接培育成品種，或作為育種親本，或直接洗種子實(shí)生馴化，從中培育既高抗又優(yōu)質(zhì)的新品種，根本上解決產(chǎn)業(yè)上優(yōu)質(zhì)而不抗病的問題.此外，可將上述抗性種質(zhì)用作中華種內(nèi)抗性雜交的抗病親本，構(gòu)建抗感F1雜交群體進(jìn)行抗病基因的QTL定位，用于分子抗性機(jī)理研究及關(guān)鍵抗病基因挖掘驗(yàn)證，加快中華獼猴桃抗性育種進(jìn)程.