李自立，師尚禮，阿蕓，張輝輝，李小龍

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）雜交制種在商業(yè)化生產(chǎn)中，采用化學(xué)、人工去雄的方式，費時、費力，雄性不育系的發(fā)現(xiàn)能夠從根本上解決上述問題［1］。雄性不育是指植物在有性繁殖過程中受遺傳基礎(chǔ)和外界因素的影響，不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子的現(xiàn)象，此外，雄性不育在高等植物中廣泛存在，利用其進行雜交制種工作，不僅提高了雜交種的產(chǎn)量又保證了子代雜種優(yōu)勢的表型［2-3］。

植物的花蕾在發(fā)育過程中需要經(jīng)一系列形態(tài)和生理生化等方面的變化，這些變化可能直接或間接地影響育性，如絨氈層細胞的異常發(fā)育，就有可能導(dǎo)致花粉粒敗育，形成雄性不育［1-2］。有關(guān)學(xué)者對雄性不育和可育的生理生化過程研究發(fā)現(xiàn)，雄性不育系在能量代謝、物質(zhì)代謝等方面與保持系有明顯的差異［4-5］，雄性不育系花藥的可溶性蛋白、脯氨酸、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等生理生化指標與其保持系存在差異［6-8］。雄性不育系可溶性糖含量低于保持系，羅茜等［9］和李玉青等［10］認為可溶性糖的缺乏是因合成受阻所致，可能與絨氈層的異常發(fā)育有關(guān)；脯氨酸是花藥中氨基酸的主要存儲形式，能轉(zhuǎn)化成其他種類的氨基酸［11］，其含量的變化能夠體現(xiàn)植物體的發(fā)育程度，而且在枸杞（Lycium chinense）［11］和蔥（Allium fistulosum）［12］等植物中雄性不育株脯氨酸的含量顯著低于正常植株；桑世飛［13］對油菜（Brassica napus）的研究中發(fā)現(xiàn)活性氧在植物生命活動中發(fā)揮著極其重要的作用，因為氧代謝過程的改變會損傷植物膜結(jié)構(gòu)從而影響其正常的代謝平衡，并且活性氧的增加會致使丙二醛含量激增。

清水紫花苜蓿作為新發(fā)現(xiàn)的一類根莖型紫花苜蓿種質(zhì)，于2010年馴化為栽培品種，其品種登記號為412［14］。該種質(zhì)主要生長在甘肅省清水縣和定西半陰濕山腳地帶，其根頸部較長，易形成根莖混雜區(qū)，根莖距地表相對較深，沒有主根，全部為水平或斜生的根莖根；莖一般為平臥或半平臥生長，比直根型和根蘗型的莖纖細矮小，其耐旱、耐寒、耐踐踏，是優(yōu)質(zhì)的放牧型和水土保持草種，但由于其產(chǎn)量相對較低，存在著巨大的改良空間［15］。近年來，在清水紫花苜蓿群體中發(fā)現(xiàn)了開花多、結(jié)籽率低的育性變異植株，使培育不育系利用雜交優(yōu)勢技術(shù)改良清水紫花苜蓿產(chǎn)量成為可能。然而清水紫花苜蓿的研究主要聚焦在細胞學(xué)水平［16］、抗逆生理水平［17-18］和分子水平［19］上，而對育性方面的研究鮮有報道。因此，本研究通過對清水紫花苜蓿育性變異株進行花粉活力染色鑒定和相關(guān)生理分析，為形成清水紫花苜蓿不育系及雜交育種提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗布設(shè)在甘肅省蘭州市安寧區(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗站，地處黃土高原西端（105°41′E，34°05′N），海拔1525 m，屬溫帶半干旱大陸性氣候，光照充足，氣候干燥，晝夜溫差大，年日照時數(shù)2600 h，無霜期171 d，年均溫10.3℃，年平均降水量300 mm左右，區(qū)內(nèi)地勢平坦，肥力均勻，為黃綿土。灌溉采用滴灌方式。

1.2 試驗材料

供試材料為清水紫花苜蓿育性變異株系GN-A1、GN-A2、GN-A3、GN-A4、GN-A5、GN-A6和育性正常株系，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點實驗室提供。

1.3 試驗設(shè)計

2016年5月中旬，從甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)會寧牧草試驗基地清水紫花苜蓿群體中發(fā)現(xiàn)了植株花蕾數(shù)多而結(jié)籽率低的6株育性變異的清水紫花苜蓿植株（分別標記為GN-A1、GN-A2、GN-A3、GN-A4、GN-A5和GN-A6），挖取單株分株栽培繁殖，移栽于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗站形成株系進行觀察，株系小區(qū)總面積16.79 m2（長7.3 m、寬2.3 m），2020年10月-2021年9月進行試驗。

2020年8月10日，在6個株系中隨機選取花藥未開裂花蕾，使用I2-KI溶液對所選取的試驗材料進行染色活力鑒定，以正常育性清水苜蓿為對照（CK），根據(jù)花蕾的形態(tài)特征采集不同時期花蕾，結(jié)合鏡檢結(jié)果將其劃分為Ⅰ期（現(xiàn)蕾期24 h）、Ⅱ期（現(xiàn)蕾期40 h）、Ⅲ期（現(xiàn)蕾期60 h）、Ⅳ期（現(xiàn)蕾期68 h）、Ⅴ期（現(xiàn)蕾期84 h）5個發(fā)育階段。采收后于-80℃下貯藏20 d后測定。本試驗采用孫寰等［3］的育性劃分標準（表1）。試驗重復(fù)3次，取其平均值，以平均值±標準誤表示。

1.4 測定指標及方法

1.4.1花粉活力測定 每一單株選取未開裂花藥小花各5朵，隨機取少數(shù)花粉粒于載玻片上混合，滴加1～2滴I2-KI溶液，蓋上玻片。然后置于低倍顯微鏡下觀察，選取3個視野，將花粉活力平均值作為花粉粒的活力值。凡被染成藍黑色或藍色的表明花粉活力強，不能被染色的則表現(xiàn)為黃褐色或黃色，證明其為活力低的花粉或不育花粉。參照王學(xué)奎［20］的方法進行活力測定。

1.4.2生理指標測定 游離脯氨酸（free proline，Pro）含量采用酸性茚三酮比色法測定［1］、可溶性糖（soluble sugar，SS）、淀粉（starch，Sta）含量采用蒽酮比色法測定［21］、可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定［20］、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定［22］、超氧化物歧化酶活性（superoxide dismutase，SOD）采 用 硝 基 四 氮 唑 藍（nitroblue tetrazolium，NBT）法［20］測 定、過 氧 化 物 酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法［21］測定、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法［22］測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0以及Excel 2010進行統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)處理，采用Adobe Photoshop CC 2019對圖片進行處理。變異系數(shù)（coefficient of variation，C.V）=標準偏差/平均值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒育性鑒定

供試材料花粉粒染色情況見圖1，可育株（CK）的花粉粒數(shù)量較多且被染成深色或黑色的高達98.37%，其中95%以上的花粉粒呈圓球形，花粉粒飽滿，表明花粉活力極高。GN-A1、GN-A2、GN-A3和GN-A6的（表2）花粉粒數(shù)量少、大小不一、基本未染色且花粉粒多呈橢圓形或畸形、花粉粒干癟并顯現(xiàn)出黃色或淡黃褐色，敗育率分別為98.99%、97.93%、98.81%和97.97%，據(jù)育性劃分標準，GN-A1、GN-A2、GN-A3、GN-A6初步鑒定其為不育株。GN-A4、GN-A5的花粉粒僅有個別被染成深色或藍黑色，敗育率分別為45.20%、36.40%，個別花粉粒呈不規(guī)則形狀，所以，GN-A4屬于典型半不育株，而GN-A5為半不育株。

表2 供試材料花粉粒染色率和敗育率Table 2 Pollen grain staining rate and sterility rate of fertile and sterile plants

2.2 不育株和可育株花蕾營養(yǎng)物質(zhì)含量的發(fā)育時期動態(tài)變化

2.2.1可溶性糖和可溶性蛋白含量的發(fā)育時期動態(tài)變化 不育株SS含量整體呈先降后升趨勢，在第Ⅴ時期達到最高（16.62 mg·g-1），第Ⅱ時期為最低，且第Ⅴ時期較第Ⅱ時期高出了132.95%（圖2）；可育株呈降低-升高-降低趨勢，第Ⅳ時期值最大（17.63 mg·g-1），第Ⅱ時期最低（7.60 mg·g-1），且第Ⅳ時期較第Ⅱ時期高出了131.97%。與可育株相比，不育株變化幅度較小，在第Ⅰ時期不育株SS含量較可育株顯著增加了37.40%，而第Ⅳ時期不育株（12.39 mg·g-1）較可育株顯著降低了29.72%；在其他時期，二者間差異不顯著（P＞0.05）。

可育株和不育株SP含量整體均呈緩慢下降趨勢，隨時間推移，不育株和可育株均以第Ⅰ時期為最高點（35.24和44.07 mg·g-1），第Ⅴ時 期 為 最 低 點（19.82和19.35 mg·g-1），且 不 育 株 最 大 值 較 最 小 值 增 加 了77.80%。不育株在第Ⅲ～Ⅳ時期急劇下降，而可育株在第Ⅰ～Ⅱ時期下降幅度最大。第Ⅰ時期不育株（35.24 mg·g-1）顯著低于可育株（44.07 mg·g-1），較可育株降低了20.04%（P＜0.05）；其他時期兩者間差異不顯著（圖2）。

2.2.2淀粉和游離脯氨酸含量的發(fā)育時期動態(tài)變化 不育株花蕾淀粉含量的時期動態(tài)變化為先下降后上升趨勢（圖3），以第Ⅱ時期為拐點，且為最小值（1.02 mg·g-1），而在第Ⅴ時期達到最大值（1.45 mg·g-1）?？捎甑矸酆空w呈平緩上升趨勢；不育株最高值低于可育株最低值，其中，第Ⅱ時期不育株顯著低出可育株43.33%（P＜0.05），第Ⅲ～Ⅴ時期，分別極顯著低出可育株28.29%、34.19%、34.35%（P＜0.01）。

不育株游離脯氨酸含量動態(tài)變化為先下降后上升，以第Ⅰ時期為最大值（573.55 μg·g-1FW），第Ⅳ時期為最小值（268.75 μg·g-1FW），且第Ⅰ時期較第Ⅳ時期高出了113.41%；可育株亦呈先下降后上升趨勢，但第Ⅲ時期為最小值（258.08 μg·g-1FW）。第Ⅲ時期，不育株P(guān)ro含量顯著高出可育株38.73%（P＜0.05），而其他時期兩者間差異不顯著。

2.3 不育株和可育株花蕾膜脂過氧化指標的發(fā)育時期動態(tài)變化

2.3.1過氧化氫酶和過氧化物酶活性的發(fā)育時期動態(tài)變化 不育株CAT活性呈先急劇下降后緩慢上升趨勢（圖4），以第Ⅱ時期為最小值（12.72 mg·g-1·min-1FW），第Ⅰ時期達到最大值（21.39 mg·g-1·min-1FW），而可育株呈緩慢上升趨勢。在第Ⅰ～Ⅴ發(fā)育時期，第Ⅰ時期不育株極顯著高出可育株65.35%（P＜0.01）；第Ⅱ時期不育株較可育株顯著增加了4.35%；第Ⅳ時期不育株顯著低出可育株10.32%（P＜0.05）。

不育株P(guān)OD活性變化趨勢為倒N字型，以第Ⅲ、Ⅳ時期為拐點，在第Ⅰ時期達到最高點，而第Ⅴ時期為最低點，且高出了76.18%；反觀可育株，整體為先下降后平緩的變化趨勢，其中，在第Ⅰ～Ⅱ時期變化幅度較明顯。在同一時期不同處理間相比，在第Ⅰ、Ⅴ時期不育株分別顯著高出可育株31.57%、24.61%（P＜0.05），在第Ⅱ、Ⅳ時期不育株分別極顯著高出可育株25.78%、89.12%（P＜0.01）。

2.3.2丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的發(fā)育時期動態(tài)變化 隨著發(fā)育時期的變化，不育株和可育株的SOD活性整體呈下降趨勢（圖5），除第Ⅴ時期，其他時期不育株均極顯著高于可育株（P＜0.01），且分別高出了39.66%、61.67%、63.90%、71.88%；二者均在第Ⅰ時期活性達到最高，分別是306.31、219.32 U·g-1FW。此外，不育株和可育株的第Ⅰ與Ⅴ時期分別相差2.06、1.65倍。不育株花蕾SOD活性在第Ⅰ～Ⅲ時期和Ⅲ～Ⅴ時期下降至最低點，可育株下降趨勢與不育株相近。

不育株和可育株MDA含量的變化趨勢基本相近，均呈M型趨勢，在第Ⅲ時期達到最低，分別為156.78、150.66 nmol·g-1FW，而在第Ⅱ時期均達到了最高點，分別為185.88和216.68 nmol·g-1FW。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ時期不育株MDA含量分別顯著低出可育株14.22%、14.22%和12.02%。

2.4 變異分析

由表3可知，不育株第Ⅰ～Ⅴ發(fā)育時期，MDA含量的變異幅度較小，其變異系數(shù)為1.42%～4.53%，而SS、SP含量和CAT、POD、SOD活性的變異幅度較大，變異系數(shù)分別為6.17%～13.32%、1.21%～11.37%、1.30%～8.70%、2.02%～6.04%和2.04%～6.16%，說明在不育株花蕾發(fā)育時期MDA含量變異較穩(wěn)定，而CAT、POD、SOD活性和SS、SP含量變異較豐富；反觀可育株，Pro含量、SOD、CAT和POD活性在第Ⅰ～Ⅴ發(fā)育時期其變異幅度較小，而SS、Sta含量變異幅度較大，說明SS、Sta含量在可育株和不育株花蕾的發(fā)育時期均不穩(wěn)定。

表3 不育株與可育株變異系數(shù)分析Table 3 Analysis of variation coefficient of sterile and fertile plants（%）

3 討論

植物正?；ǚ勰軌蚍e累較多淀粉，I2-KI溶液可將其染成藍色或深色，而不育花粉往往積累較少或不含淀粉［2］。根據(jù)淀粉遇碘變藍的特性，可從花粉粒內(nèi)部染色的比率或顏色深淺來判定花粉粒中的淀粉含量，從而確定花粉育性［23］。劉海英等［24］通過對小麥（Triticum aestivum）花粉粒染色可知，不育花粉染色結(jié)果為非正常深褐色或黃色，花粉粒呈不規(guī)則狀，而可育花粉粒為深色且飽滿。本研究清水苜蓿不育株GN-A1、GN-A2、GN-A3、GN-A6花粉染色多呈黃色或淡黃褐色，且表現(xiàn)為橢圓形或畸形、花粉粒干癟、形狀不一，染色率均低于5%；可育株（CK）花粉粒被染成深色或黑色的近乎100%，其中95%以上花粉粒呈圓球形且飽滿，說明活力極高；GN-A4、GN-A5花粉粒染成深色或藍黑色的分別占54.80%和63.60%，個別呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀，為典型半不育株和半不育株。

不育株的產(chǎn)生受環(huán)境、細胞結(jié)構(gòu)、生理變化及基因等多種因素的影響［25］。此外，育性還受日長與溫度的共同影響，不適的光溫條件使植株中正常的基因表達被遏制，從而導(dǎo)致多種酶活性發(fā)生改變，引起代謝失調(diào)，使得植株同化能力降低，某些物質(zhì)分解加速，花粉發(fā)育所必需的物質(zhì)和能量得不到充分供應(yīng)，從而導(dǎo)致花粉不能發(fā)育［26］。劉淑娟等［27］認為礦質(zhì)元素的變異也會對植物的育性產(chǎn)生影響，如花粉的敗育均與鈣、鎂和鉀元素的變化有關(guān)，錳的含量變化也會影響到某些酶的活性，從而影響育性。同樣，物質(zhì)代謝作為植物生命活動的基礎(chǔ)，而物質(zhì)代謝之間的差異會反映在各個生理指標上，物質(zhì)代謝的異常與植物的雄性不育密切相關(guān)，而碳水化合物作為花藥發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)及物質(zhì)合成的原料物質(zhì)，其含量的短缺會影響花粉的發(fā)育［28-30］。王瑩等［1］通過對紫花苜蓿雄性不育株（MS-GN1A）的研究發(fā)現(xiàn)，可育株花蕾的脯氨酸和可溶性糖含量呈先下降后上升趨勢，且各個時期不育株可溶性糖含量都低于可育株，本研究結(jié)果與之相近，說明脯氨酸和可溶性糖含量的不足可能會導(dǎo)致不育。本研究結(jié)果顯示，除了第Ⅰ時期，第Ⅱ～Ⅴ時期不育株可溶性蛋白含量與可育株差異不顯著，與梁艷榮等［31］、孫日飛等［32］的研究結(jié)論一致。可育株淀粉含量隨花蕾發(fā)育明顯升高，在第Ⅴ時期達到最大值，整個發(fā)育階段可育株淀粉含量均高于不育株，與王瑩等［1］和蔣會兵等［33］的研究結(jié)果一致。不育株和可育株MDA含量均呈M型變化趨勢，在第Ⅲ和Ⅴ階段不育株略高于可育株，其他均低于可育株，與王瑩等［1］的結(jié)果相似。POD與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化均具有密切的關(guān)系［34］，而CAT和SOD能夠清除代謝過程中多余的有氧自由基［35］。何思等［7］研究發(fā)現(xiàn)，不育材料苧麻（Boehmeria nivea）在幼蕾期POD活性最高，且低于可育株；王瑩等［1］和王永琦［35］發(fā)現(xiàn)不同階段的不育株花蕾POD、SOD活性均高于可育株，而CAT活性僅在第Ⅰ、Ⅱ階段高于可育株，本試驗結(jié)果與此一致。

植物花蕾在發(fā)育過程中，其生理特征會發(fā)生很大變化，從而導(dǎo)致育性發(fā)生改變［36］，而變異系數(shù)是反映遺傳變異程度大小的指標，可以衡量不同變量的變異程度及穩(wěn)定性［37］，對于不育材料的生理變化和育種研究具有重要意義。本研究中從不育株第Ⅰ～Ⅴ發(fā)育時期來看，MDA含量的變異幅度較小，而SS、SP含量和CAT、POD、SOD活性的變異幅度較大，說明在不育株花蕾發(fā)育時期MDA含量變異較穩(wěn)定，而其他生理指標變異較豐富；反觀可育株，Pro含量、SOD、CAT和POD活性的變異幅度較小，而SS、Sta含量變異幅度較大，說明SS、Sta含量在可育株和不育株花蕾的發(fā)育時期均不穩(wěn)定。

4 結(jié)論

通過I2-KI法染色，GN-A1、GN-A2、GN-A3及GN-A6初步鑒定為不育株，GN-A4和GN-A5分別為典型半不育株和半不育株?；ɡ匐S著發(fā)育時期的進行，不育株的SS、SP、Sta、Pro含量均在不同階段出現(xiàn)不足；膜脂過氧化指標出現(xiàn)紊亂，影響了膜脂穩(wěn)定性從而導(dǎo)致育性發(fā)生變化，且在第Ⅲ～Ⅳ階段的變化最為顯著，因此這一階段是育性產(chǎn)生異常的關(guān)鍵所在。