林濤，張立嬌，韓蓉蓉，玉永雄，蔣曹德*

（1.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶市草食動物資源保護(hù)與利用工程研究中心，重慶 400715；2.廣安市飼料工業(yè)管理站，四川 廣安 638000）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界公認(rèn)的蛋白質(zhì)豐富的豆科牧草，被譽(yù)為“牧草之王”，為現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的蛋白飼料。近年，南方地區(qū)草食畜牧業(yè)發(fā)展迅速，對紫花苜蓿的需求劇增。但是，南方地區(qū)土壤多為酸性，其中的鋁離子（主要為Al3+）對紫花苜蓿產(chǎn)生嚴(yán)重的鋁毒危害［1-2］。而且，苜蓿屬植物缺乏耐鋁遺傳物質(zhì)，采用常規(guī)育種方法培育紫花苜蓿耐鋁品種缺乏可行性［3-4］。因此，借助分子育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入耐鋁基因已成為培育紫花苜蓿耐鋁毒品種的必然選擇。

酸性土壤生長植物進(jìn)化出兩種耐鋁機(jī)制，一種是內(nèi)部耐受機(jī)制，包括細(xì)胞內(nèi)有機(jī)酸的螯合、細(xì)胞區(qū)室化等；另一種為外部排斥機(jī)制，包括細(xì)胞壁的固定、根尖有機(jī)酸的分泌等［1-2］。目前發(fā)現(xiàn)，Al3+誘導(dǎo)根尖分泌的有機(jī)酸包括草酸、蘋 果 酸和檸檬酸，但 是 大 豆（Glycine max）、柱 花 草（Stylosanthes guianensias）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）和大麥（Hordeum vulgare）等眾多耐鋁植物的研究證實(shí)根尖分泌檸檬酸是植物解鋁毒的關(guān)鍵機(jī)制［1-2］。作為Al3+進(jìn)入原生質(zhì)體的第一道屏障，細(xì)胞壁在植物鋁毒中的作用近年來得到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)根細(xì)胞壁木質(zhì)素含量與植物耐鋁性密切相關(guān)［5］，尤其木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）已被證明在生物和非生物脅迫、機(jī)械損傷抗性等生物過程中具有重要作用［6-7］。4CL催化肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的硫酯，是連接木質(zhì)素、黃酮、軟木脂、芪類、香豆素和細(xì)胞壁結(jié)合的酚類等前體與苯丙烷類代謝各個分支途徑的紐帶［5］。楊樹（Populus）、煙草和擬南芥等植物的研究揭示4CL基因家族被病原體感染、紫外線輻射、干旱脅迫等外界刺激誘導(dǎo)表達(dá)，4CL基因催化產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在生長、發(fā)育和環(huán)境互作中具有重要的作用［5，8］。盡管4CL基因已被證明在生物和非生物脅迫中具重要作用，但與檸檬酸分泌相關(guān)的耐鋁功能研究還未見報道。

大量文獻(xiàn)報道，大豆品種“丹波黑”（G.maxcv.Tamba）適應(yīng)酸性土壤生長，Al3+誘導(dǎo)其根尖分泌檸檬酸是其主要的解鋁毒機(jī)制［1-2］。作者前期利用RNA-seq技術(shù)檢測到丹波黑大豆Gm4CL2基因被Al3+誘導(dǎo)表達(dá)，但是在Al3+脅迫和非脅迫下未檢測到紫花苜蓿同源基因的表達(dá)。本研究進(jìn)一步克隆Gm4CL2全長編碼序列，揭示其在Al3+脅迫下對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、檸檬酸分泌以及紫花苜蓿耐鋁性的影響，以期鑒定Gm4CL2的耐鋁功能以及為基于檸檬酸分泌相關(guān)基因培育紫花苜蓿耐鋁品種積累育種材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

丹波黑大豆種子由日本京都大學(xué)提供；擬南芥Col-0和渝苜1號紫花苜蓿種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。于2020年3月，使用1% NaClO對丹波黑大豆和紫花苜蓿種子消毒20 min，用雙蒸餾水洗滌3次后于濕潤濾紙上孵育2 d（n=3）。發(fā)芽后，將幼苗移栽到1/2霍格蘭營養(yǎng)液（pH 6.0）于25℃/20℃（晝/夜）200 μmol·m-2·s-1恒光條件下培養(yǎng)。將種子滅菌后播種于1/2 MS瓊脂培養(yǎng)基上，選取長勢一致的野生型及Gm4CL2過表達(dá)植株在1/2的霍格蘭營養(yǎng)液中進(jìn)行水培。

1.2 Gm4CL2基因克隆與序列分析

使用RNAiso Plus（Takara，大連）提取丹波黑大豆2周幼苗根尖（0～2 cm）總RNA，Prime ScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Takara，大連）反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板。根據(jù)大豆基因組序列設(shè)計Gm4CL2全長編碼序列引物Gm4CL2-F和Gm4CL2-R（表1），cDNA為模板，按照PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（Taraka，大連）說明書配制PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃10 s，58℃2 min；72℃30 s，32個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒（OMEGA，美國）進(jìn)行回收，并與pMD19-T（Taraka，大連）載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落送商業(yè)測序（深圳華大基因股份有限公司，重慶）。獲得的序列在NCBI進(jìn)行Blastx比對，挑選雙子葉植物4CL同源蛋白質(zhì)序列采用MEGA 7.0進(jìn)行多序列比對，并用鄰接法［8］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物序列信息Table 1 Primer information

1.3 Gm4CL2過表達(dá)載體的構(gòu)建、亞細(xì)胞定位及遺傳轉(zhuǎn)化

以1.2部分含有PMD19T-Gm4CL2陽性大腸桿菌為模板，利用引物Gm4CL2-F和Gm4CL2-R擴(kuò)增的Gm4CL2的全長編碼序列。XbaⅠ、SmaⅠ分別雙酶切PMD19T-Gm4CL2和pBI121-eGFP，回收產(chǎn)物用T4連接酶于16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化DH5α。菌落PCR檢測后挑取陽性菌落，利用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取質(zhì)粒，凍融法［8］轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌LBA4404，利用浸花法［9］遺傳轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。對于紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化，上述方法構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-Gm4CL2-mCherry，按照Wei等［8］采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的葉盤法導(dǎo)入紫花苜蓿渝苜1號高頻再生15號植株［10］。簡而言之，剪取紫花苜蓿無菌苗的葉片（0.5 cm×0.5 cm），于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h；取農(nóng)桿菌pCAMBIA1300-35S-Gm4CL2-mCherry侵染紫花苜蓿葉片30 min；吸干菌液，置于共培養(yǎng)基2 d，移至分化培養(yǎng)基（培養(yǎng)基每2周更換一次），至分化出幼苗；在出芽培養(yǎng)基上用LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源篩選得到帶紅色熒光的芽點(diǎn)，并進(jìn)行生根培養(yǎng)，在生根培養(yǎng)基上通過LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源篩選帶紅色熒光的Gm4CL2過表達(dá)陽性植株。

對于亞細(xì)胞定位，XbaⅠ、SmaⅠ分別雙酶切PMD19T-Gm4CL2和pHBT-GFP-NOS，構(gòu)建pHBT-Gm4Cl2-eGFP-NOS載體，瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。取未抽苔的擬南芥葉片制備原生質(zhì)體，以pHBT-eGFP-NOS&PMrk為細(xì)胞膜定位標(biāo)記，以pHBT-eGFP-NOS為空載體，取pHBT-Gm4Cl2-eGFP-NOS質(zhì)粒，加入制備好的原生質(zhì)體中，23℃弱光，孵育16 h，于激光共聚焦顯微鏡（LSM 800，Zeiss，德國）下觀察。

1.4 Gm4CL2過表達(dá)擬南芥陽性植株的篩選

于2020年3月，將擬南芥種子在含有卡那霉素（kanamycin，Kn）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選在培養(yǎng)基上長勢一致的擬南芥進(jìn)行土培（n=3）。生長兩周后收集葉片組織，提取DNA與RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA；分別以DNA和cDNA為模板，按照1.2部分的方法利用引物Gm4CL2-F、Gm4CL2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將收獲的T0種子放置含有50 mg·L-1Kn的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集陽性植株種子為T1代，再將T1代種子進(jìn)一步篩選T2代，最后篩選出T3代種子。

1.5 Real-time PCR分析

取水培2周長勢一致的丹波黑大豆幼苗，在0.5 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 4.5）中預(yù)培養(yǎng)12 h，然后在加入0（對照）、25、50、75、100 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）溶液中培養(yǎng)24 h（用于檢測不同Al3+濃度對Gm4CL2表達(dá)的影響），或者在50 μmol·L-1AlCl3的條件下分別處理0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h（用于檢測不同鋁處理時間對Gm4CL2表達(dá)的影響），或者在AlCl3、MnCl3、FeCl3、GaCl3和LaCl3（濃度均為50 μmol·L-1）條件下分別處理24 h［11］（用于檢測不同金屬離子對Gm4CL2表達(dá)的影響），每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15株。取0～2 cm根尖組織，液氮速凍后于-80℃保存。為了檢測不同組織和根部不同區(qū)段Gm4CL2表達(dá)的差異，將預(yù)培養(yǎng)的植株在50 μmol·L-1AlCl3處理24 h，取0～2 cm、2～4 cm和4～6 cm的根部組織。對于擬南芥Gm4CL2、AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2基因表達(dá)檢測，在50 μmol·L-1AlCl3處理24 h和非處理?xiàng)l件下收集T3代水培2周的根、莖、葉（0～2 cm）組織。采用RNAiso Plus和Prime ScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Taraka，大連）分別進(jìn)行RNA提取與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以表1中各基因引物，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Taraka，大連）說明書進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增；以大豆18S rRNA基因或者擬南芥β-actin為內(nèi)參提取，采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達(dá)量［12］。

1.6 擬南芥和紫花苜蓿耐鋁性分析

1.6.1根伸長量測定 將野生型和T3代Gm4CL2過表達(dá)擬南芥種子用7%次氯酸鈉溶液消毒滅菌10 min后，無菌水清洗3次置于1/2 MS培養(yǎng)基（pH 5.8）培養(yǎng)3 d萌發(fā)。然后，將擬南芥幼苗移入含有50、100、150、200 μmol·L-1AlCl3的1/2 MS培養(yǎng)基中生長，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)15株。14 d后直尺測量根長，計算根相對伸長率（鋁脅迫根的伸長量/無鋁脅迫根的伸長量×100%）。

選取根部長勢一致的野生型和Gm4CL2過表達(dá)紫花苜蓿（主根長約3～4 cm）3個株系，每株系5個重復(fù)，每個重復(fù)15株，于0.5 mmol·L-1CaCl2（pH 4.5）預(yù)處理12 h后，分別加入0和15 μmol·L-1AlCl3（均含0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）處理24 h后，測量第1、7天的主根長。

1.6.2鋁含量測定 選取根生長一致的野生型和Gm4CL2過表達(dá)擬南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）條件下處理24 h，以非處理組為對照，每個處理5個重復(fù)，每個處理15株。對于野生型和Gm4CL2過表達(dá)紫花苜蓿采用15 μmol·L-1AlCl3（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）處理24 h［10］。取根尖烘干至恒重，粉碎后取2 g加入10 mL濃硝酸靜置過夜；加60%高氯酸3 mL，加熱至沸后冷卻；去離子水過濾定容，采用原子熒光光度計（Lumina 3400，Aurora，加拿大）測定樣品鋁含量。

1.6.3伊文思藍(lán)和鉻天青S染色 將0和50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）處理24 h的野生型和T3代擬南芥種子用超純水沖洗15 min，幼苗根部分別浸入0.25%的伊文思藍(lán)和0.1%鉻天青S染色液中染色15 min，超純水沖洗15 min后用體視鏡拍照，3個重復(fù)。

將野生型和Gm4CL2過表達(dá)紫花苜蓿（主根長約3 cm）在0、15 μmol·L-1AlCl3的溶液（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）中處理24 h后，按照上述方法進(jìn)行伊文思藍(lán)染色。

1.7 檸檬酸分泌量測定

0和50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）分別處理野生型和T3代擬南芥水培2周幼苗，或者15 μmol·L-1AlCl3（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）處理野生型和Gm4CL2過表達(dá)紫花苜蓿水培2周幼苗，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15株。24 h后，測量根重并收集處理液體，用檸檬酸（citric acid，CA）ELISA試劑盒（上海貝博生物科技公司）測定處理液中的檸檬酸含量。

1.8 活性氧與抗氧化能力檢測

選取根生長一致的野生型和Gm4CL2過表達(dá)擬南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）條件下處理24 h，每個處理3個重復(fù)，每個處理15株。取0～2 cm根尖，按照活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒說明書（上海優(yōu)選試劑有限公司），采用DCFH-DA熒光探針和分光光度法［11］分別測定ROS、MDA含量以及POD、SOD活性。

1.9 細(xì)胞壁成分分析

選取根生長一致的野生型和Gm4CL2過表達(dá)擬南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）條件下處理24 h，取0～2 cm根尖，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15株。根據(jù)木質(zhì)素和果膠含量測定試劑盒說明書（上海優(yōu)選試劑有限公司），將樣品烘干、粉碎、過篩后加入各試劑混合，放入96孔板中，于280 nm處測吸光度值A(chǔ)，木質(zhì)素和果膠（mg·g-1FW）=0.147×（A樣品-A空白-0.0034）/樣本質(zhì)量×稀釋倍數(shù)。采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［13］測定擬南芥木質(zhì)素途徑中小分子含量（上海優(yōu)選試劑有限公司）?；贛ETLIN（metabolite link）數(shù)據(jù)庫，對分級和二級光譜進(jìn)行定性分析。使用Analyst 1.6.3進(jìn)行定性和定量分析。采用BCA蛋白定量試劑盒（上海優(yōu)選生物技術(shù)有限公司）測定可溶性蛋白含量。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±standard deviation，SD），用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析與Tukey多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gm4CL2基因的克隆與序列分析

以丹波黑大豆根尖cDNA為模板，PCR擴(kuò)增并克隆出Gm4CL2基因，全長cDNA為1668 bp，編碼555個氨基酸（GenBank No.MW148764）。通過Blastx比對，從NCBI中選擇了16個雙子葉植物46個同源蛋白序列（圖1）。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，這些4CL蛋白可聚成3組，即GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ。其中在GroupⅠ中，Gm4CL2與大豆4CL4和野生大豆4CL2聚為一個亞類，為雙子葉植物中的Ⅰ類4CL。序列分析表明，Gm4CL2包含兩個在整個4CL基因家族中保守的基序，即AMP（adenosine monophosphate）結(jié)合基序和COA（coenzyme A）結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 鋁特異性誘導(dǎo)Gm4CL2基因的表達(dá)

通過real-time PCR方法檢測了不同濃度和不同時間Al3+處理下丹波黑大豆根尖Gm4CL2表達(dá)的變化。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）處理24 h，Gm4CL2在0～2 cm的根尖組織中表達(dá)量最高（圖2A，B；P＜0.05）。在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）處理24 h條件下，Gm4CL2的表達(dá)量顯著高于Fe3+、Mn3+、Ga3+和La3+處理的植株（圖2C）；0～2 cm根尖組織Gm4CL2表達(dá)量也顯著高于2～4 cm和4～6 cm的根尖組織（圖2D，P＜0.05）。

2.3 過表達(dá)Gm4CL2基因提高擬南芥的耐鋁性

為了探討Gm4CL2的耐鋁功能，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，利用PCR的方法檢測到12株T3代擬南芥的基因組中含有Gm4CL2基因，并且該基因在這些植株中得到表達(dá)。隨機(jī)選擇3個T3株系，檢測了不同濃度AlCl3處理對Gm4CL2過表達(dá)擬南芥耐鋁性的影響。結(jié)果表明，Gm4CL2蛋白亞細(xì)胞定位于擬南芥根尖細(xì)胞質(zhì)膜（圖3A）。在50、100和150 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）脅迫下，雖然Gm4CL2過表達(dá)植株和野生型擬南芥根的生長均受到抑制，但是Gm4CL2過表達(dá)株系的根相對伸長率顯著大于野生型（圖3B，C，P＜0.05）。在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）處理的條件下，Gm4CL2過表達(dá)植株根系的伊文思藍(lán)和鉻天青S染色也低于野生型（圖4A），3個Gm4CL2過表達(dá)植株根尖Al3+含量分別為野生型的0.61、0.65和0.66倍（P＜0.05，圖4B）。

2.4 過表達(dá)Gm4CL2提高擬南芥的抗氧化能力

鋁脅迫導(dǎo)致植物脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生的大量活性氧損害植物機(jī)體［14］。本研究采用DCFH-DA測定了在AlCl3脅迫下Gm4CL2過表達(dá)擬南芥和野生型擬南芥活性氧水平的變化。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）處理24 h后，Gm4CL2過表達(dá)植株根尖ROS水平比野生型顯著降低（P＜0.05），而且與非處理植株根尖ROS水平無顯著差異（P＞0.05，圖5A）。進(jìn)一步檢測了Gm4CL2對擬南芥抗氧化能力的影響，在非脅迫和脅迫條件下，Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖POD、SOD活性比野生型均有顯著的提高（P＜0.05），其中AlCl3處理植株分別為野生型的1.61、1.53、1.40倍以及1.28、1.39、1.43倍（圖5B，C）。雖然在非脅迫條件下Gm4CL2過表達(dá)植株和野生型植株其根尖MDA沒有顯著差異（P＞0.05），但是Al3+處理顯著降低了Gm4CL2過表達(dá)植株根尖MDA含量，分別為野生型根尖的0.75、0.67和0.75倍（P＜0.05，圖5D）。

2.5 Gm4CL2對擬南芥根部細(xì)胞壁成分的影響

首先測定了野生型和Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖木質(zhì)素和果膠的含量。在非Al3+脅迫下，Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖木質(zhì)素含量與野生型沒有顯著差異（P＞0.05），但是Al3+脅迫引起Gm4CL2過表達(dá)植株木質(zhì)素含量顯著降低（P＜0.05，圖6A）。另外，在Al3+脅迫和非脅迫下，Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖果膠含量均顯著降低（P＜0.05，圖6B）。

其次，為了考察Gm4CL2對木質(zhì)素合成途徑的影響，利用高效液相色譜測定了擬南芥根尖4CL代謝底物的含量。野生型和Gm4CL2過表達(dá)植物根系檢測到4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，但是未能檢測到?jīng)]食子酸、兒茶素、蘆丁、木犀草素。在非脅迫下，Gm4CL2過表達(dá)植株根尖4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸含量比野生型顯著降低（P＜0.05，圖6C～E）。在Al3+脅迫下，3個Gm4CL2過表達(dá)株系根尖4-香豆酸比野生型分別提高37.7%、38.5%和32.5%，但是咖啡酸和阿魏酸分別降低49.4%、43.6%、30.8%以及98.0%、95.5%、94.1%（P＜0.05，圖6D，E）。在非脅迫下，Gm4CL2過表達(dá)植株可溶質(zhì)蛋白比野生型植株顯著降低（P＜0.05），但是在Al3+脅迫下，兩者沒有顯著差異（P＜0.05，圖6F）。

2.6 Gm4CL2促進(jìn)擬南芥根尖檸檬酸的分泌以及鋁脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)

根尖分泌檸檬酸鰲合Al3+是丹波黑大豆、擬南芥和柱花草等植物重要的耐鋁機(jī)制［2-3，7］，因此分析了Gm4CL2與檸檬酸分泌相關(guān)的功能。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）處理后，Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖檸檬酸分泌量顯著高于野生型（P＜0.05），3個T3株系分別達(dá)到野生型的1.66、1.61和1.48倍（圖7A）。此外，在非脅迫條件下，Gm4CL2過表達(dá)植株根尖檸檬酸通道蛋白基因（AtMATE）表達(dá)與野生型沒有顯著差異（P＞0.05），但是AlCl3處理顯著上調(diào)了Gm4CL2過表達(dá)植株根尖AtMATE的表達(dá)量（P＜0.05，圖7B）。

前期文獻(xiàn)報道了水稻（Oryza sativa）的OsSTAR1和OsSTAR2/ALS3能夠減少Al3+在細(xì)胞壁中的積累和損傷［2-3］，因而進(jìn)一步檢測了Gm4CL2對這兩個基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：在Al3+脅迫下，Gm4CL2過表達(dá)植株根尖AtSTAR1表達(dá)量比野生型均顯著提高（P＜0.05，圖7C）；Gm4CL2過表達(dá)植株根尖AtSTAR2表達(dá)量在非脅迫下與野生型沒有顯著差異（P＞0.05），Al3+處理顯著上調(diào)Gm4CL2過表達(dá)植株該基因的表達(dá)量（P＜0.05，圖7D）。

2.7 Gm4CL2提高紫花苜蓿的耐鋁性與生物量

利用基因組PCR和RT-PCR篩選到3株Gm4CL2表達(dá)量較高的渝苜1號紫花苜蓿陽性植株（圖8A）。根據(jù)作者前期研究報道［10］，采用野生型渝苜1號紫花苜蓿能夠耐受的15 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）對這些陽性株系進(jìn)行脅迫處理。結(jié)果表明，Gm4CL2過表達(dá)紫花苜蓿根相對伸長率和根尖檸檬酸分泌量較野生型顯著提高（P＜0.05，圖8B，C），其根尖伊文思藍(lán)著色和Al3+含量降低（P＜0.05，圖8D，E）。雖然Al3+脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株根尖木質(zhì)素含量沒有顯著差異（P＞0.05，圖8F），但是在脅迫和非脅迫下Gm4CL2過表達(dá)植株生物量顯著高于野生型（P＜0.05，圖8G）。

3 討論

4CL蛋白家族能催化合成4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸對應(yīng)的輔酶A硫酯，然后參與苯丙烷途徑合成木質(zhì)素和可溶性代謝物的生物合成，是控制碳固定途徑的關(guān)鍵酶［5，8］。4CL基因在木質(zhì)素的形成和鹽、干旱脅迫中的重要作用在擬南芥、水稻、玉米、大豆、煙草和棉花（Gossypium）等植物中得到廣泛的研究［8，15-17］。但是，除Liu等［13］探討了4CL4基因?qū)λ灸弯X性的影響外，關(guān)于4CL基因的耐鋁功能還沒有其他的研究報道。本研究基于前期丹波黑大豆在Al3+脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了Gm4CL2基因的全長cDNA序列。

本研究發(fā)現(xiàn)Al3+特異性誘導(dǎo)Gm4CL2在丹波黑大豆0～2 cm根尖組織表達(dá)（圖2），Al3+脅迫處理造成Gm4CL2過表達(dá)株系根相對伸長率和生物量均高于野生型（圖3），但是根尖Al3+含量低于野生型（圖4A）。在水稻中，Liu等［13］也報道了Os4CL4具有減輕Al3+對根伸長的抑制作用。另一方面，在鋁等脅迫下，ROS刺激產(chǎn)生大量的MDA，造成膜流動性降低和膜功能損傷，因此MDA水平指示著衡量植物細(xì)胞膜脂過氧化程度［18-19］。植物抗氧化系統(tǒng)利用抗氧化酶（POD和SOD等）負(fù)責(zé)清除細(xì)胞ROS，并提高植物耐鋁性［20］。在Gm4CL2過表達(dá)擬南芥中，Al3+脅迫處理引起其根尖ROS和MDA水平下降，同時POD和SOD活性提高（圖5），這些結(jié)果與水曲柳（Fraxinus mandshurica）Fm4CL2和4CL-like 1的抗氧化效應(yīng)相一致［15，21］，進(jìn)一步證實(shí)了Gm4CL2的耐鋁功能。

目前從擬南芥、水稻、毛白楊（Populus tomentosa）和大豆等眾多植物中鑒定的4CL基因家族分為3類：I類主要包括擬南芥、水曲柳的4CL1、2和4，它們與木質(zhì)素的生成有關(guān)［22-23］；擬南芥At4CL3及楊樹Pto4CL2等歸為Ⅱ類，該基因激活4-香豆酸作為查耳酮合成酶的底物，參與類黃酮等苯丙化合物的生物合成；其他含有與4CL相同的保守基序和具有高度相似性的被歸類為4CL-like［16］。本研究數(shù)據(jù)表明，丹波黑大豆Gm4CL2為I類，且保留有4CL蛋白高度保守的基序（motif）：AMP結(jié)合功能域（motif I）和BoxⅡ（motifⅡ）（圖1），這顯示Gm4CL2參與木質(zhì)素合成的調(diào)控。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Al3+特異性誘導(dǎo)Gm4CL2在丹波黑大豆根尖組織表達(dá)（圖2）；在鋁脅迫下Gm4CL2過表達(dá)擬南芥根尖木質(zhì)素含量低于野生型（圖6）。Liu等［13］也發(fā)現(xiàn)4CL4及其上游肉桂酸羥化酶基因C4H2的突變降低了鋁脅迫下水稻根和葉的木質(zhì)素含量，提高了水稻的耐鋁性。然而，相關(guān)文獻(xiàn)報道楊樹Pto4CL1、水曲柳Fm4CL2和棉花Gh4CL7基因在鹽和干旱脅迫下增加木質(zhì)素的含量［15，23］。這些結(jié)果說明4CL耐鋁的功能途徑與耐鹽和耐旱不同，Gm4CL2引起的木質(zhì)素的降低有利于植物對鋁毒的抗性。

根尖細(xì)胞壁是鋁毒的首要靶標(biāo)，也是鋁積累的主要部位［5］。植物細(xì)胞壁中的果膠羧基帶負(fù)電荷，為Al3+結(jié)合的主要位點(diǎn)［5］。本研究的數(shù)據(jù)表明，Gm4CL2通過降低根尖果膠含量提高了擬南芥對鋁毒的抗性（圖6）。與上述結(jié)果不同，Gm4CL2提高了擬南芥4-香豆酸的含量（圖6），這與水稻Os4CL4和楊樹Pto4CL1研究結(jié)果一致［13，22］。實(shí)際上，最近的研究表明半纖維素也是擬南芥根尖Al3+積累的主要位點(diǎn)；阿魏酸和4-香豆酸可以通過酯鍵連接到半纖維素阿拉伯木聚糖或葡萄糖醛基阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖側(cè)鏈的C5碳上，它們通過增加半纖維素的交聯(lián)減少Al3+與細(xì)胞壁的結(jié)合［19］。尤其Wohl等［17］報道金魚藻（Anthoceros agrestis）4CL催化其底物活性大小依次降低的順序?yàn)椋寒惐帷?-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸，Liu等［13］也證實(shí)了Os4CL4對4-香豆酸、阿魏酸高度的親和性。以上結(jié)果說明，在Al3+脅迫下Gm4CL2過表達(dá)造成4-香豆酸的積累，4-香豆酸與半纖維素交聯(lián)造成Al3+與細(xì)胞壁結(jié)合能力降低，從而增強(qiáng)植株的耐鋁性。

本研究一個新的重要發(fā)現(xiàn)在于Gm4CL2提高了擬南芥在鋁脅迫下根尖AtMATE的表達(dá)與檸檬酸的分泌（圖7）。證據(jù)表明，根尖分泌檸檬酸鰲合Al3+是大豆、擬南芥、煙草、玉米、小麥和大麥等眾多耐鋁植物解鋁毒最為有效的機(jī)制之一［2-3］。前期研究通過藥理學(xué)等方法明確了柱花草根尖檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MATE在Al3+誘導(dǎo)檸檬酸分泌中的重要作用［10，24］。這些結(jié)果顯示了Gm4CL2與檸檬酸分泌相關(guān)的耐鋁功能。另一方面，STAR1和STAR2分別含有ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，它們形成復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)UTP-葡萄糖參與細(xì)胞壁的修飾，掩蓋Al3+結(jié)合位點(diǎn)［2-3］。Gm4CL2提高擬南芥株系A(chǔ)tSTAR1和AtSTAR2的表達(dá)（圖7）進(jìn)一步證實(shí)了該基因參與細(xì)胞壁的修飾。但是，Gm4CL2對AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2調(diào)控等耐鋁的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

前期研究報道紫花苜蓿在3～5 μmol·L-1AlCl3處理24 h后，根伸長明顯受阻［10，25］。渝苜1號紫花苜蓿是在南方的酸性土壤上選育出來的，能夠耐受低于15 μmol·L-1AlCl3的脅迫，但是我國南方酸性土壤中游離鋁離子濃度平均在20 μmol·L-1左右［10］，渝苜1號紫花苜蓿耐鋁性需要進(jìn)一步提高。雖然研究人員在鑒定植物耐鋁機(jī)制、利用分子育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入耐鋁基因提高紫花苜蓿耐鋁性方面進(jìn)行了一些嘗試，但是目前的研究主要集中在CS和MATE等與檸檬酸合成和分泌相關(guān)的單個下游基因［2，10］，未考慮其他途徑和多個基因的作用，對于改善紫花苜蓿等植物的耐鋁性效果不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Gm4CL2基因紫花苜蓿比野生型具有較強(qiáng)的耐鋁性；在鋁脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量與野生型沒有差異，但是生物量提高（圖8）。由于苜蓿干物質(zhì)的消化率與木質(zhì)素的含量極顯著負(fù)相關(guān)，木質(zhì)素含量過高會降低紫花苜蓿品質(zhì)［26］，因此Gm4CL2可用來提高紫花苜蓿的耐鋁性，有望在不改變牧草品質(zhì)的基礎(chǔ)上提高酸性條件下紫花苜蓿的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

Gm4CL2為丹波黑大豆的耐鋁基因。Gm4CL2能夠降低果膠的含量，增強(qiáng)細(xì)胞壁的修飾、抗氧化能力和檸檬酸分泌，從而提高擬南芥和紫花苜蓿對鋁毒的抗性。