崔險峰，丁 攀

(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 300100)

隱匿性精子癥是指精液標本在常規(guī)顯微鏡檢下未發(fā)現(xiàn)精子，而在離心后的沉淀中發(fā)現(xiàn)少量精子[1]。這些患者的睪丸中存在局灶性的精子發(fā)生區(qū)[2]，隨著卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，采用精液中極少量的精子或睪丸提取的精子行ICSI治療，可以使這些患者擁有自己的遺傳學(xué)后代[3]。然而，既往隱匿性精子癥患者采用精液中精子或睪丸提取精子行ICSI對治療結(jié)局影響的報道多存有爭議[4]。因此，本研究回顧性分析了本中心此類患者的臨床資料，旨在闡明在隱匿性精子癥患者的輔助生殖中采用精液精子和睪丸提取精子對ICSI臨床結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年3月至2020年2月在本中心接受試管嬰兒治療，且須同時滿足以下7個條件的夫婦納入本研究：(1)男方診斷為隱匿性無精子癥；(2)女方診斷為女性生育力未見異常；(3)女方年齡<35周歲；(4)促排方案為促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案；(5)獲得成熟卵子個數(shù)≥5個；(6)妻子取卵日，男方精液中找到足夠行ICSI的活動精子，或精液中未找到精子但通過外科取精術(shù)[睪丸細針抽吸精子術(shù)/睪丸常規(guī)切開取精子術(shù)/顯微睪丸切開取精術(shù)(TESA/TESE/Mic-TESE)]從睪丸中獲得足夠行ICSI的活動精子；(7)妻子促排取卵后即行新鮮周期移植。排除在1個周期中既采用精液精子，同時也采用睪丸提取精子的夫婦。共統(tǒng)計分析418例隱匿性精子癥患者的ICSI結(jié)果。其中317例采用精液精子行ICSI治療，101例采用睪丸提取精子(其中采用TESA取精8例，采用TESE取精45例，采用Mic-TESE取精48例)行ICSI治療。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1精液的處理

妻子取卵日當天，隱匿性精子癥患者先采用手淫體外排精，胚胎實驗室收集精液標本并離心處理。具體操作：收集到的精液標本放置在37 ℃水浴箱中充分液化，將液化后的精液轉(zhuǎn)入裝有1.5 mL梯度離心培養(yǎng)液(ART-2080，美國CooperSurgical公司)的離心管,3 000×g離心20 min，棄上清液，加入1.5 mL洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司),混勻后再次3 000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入500 μL洗精受精液，混勻后移入培養(yǎng)皿中備用。若發(fā)現(xiàn)活精子，則采用這些精子行ICSI治療；若未發(fā)現(xiàn)活精子，則安排患者第2次體外手淫取精，若取得標本處理后發(fā)現(xiàn)活精子，則采用這些精子行ICSI治療；若患者第2次取得精液標本處理后未發(fā)現(xiàn)活精子或第2次體外手淫取精失敗，則行外科睪丸取精術(shù)取精。

1.2.2睪丸精子的提取、處理及行ICSI后剩余精子的冷凍保存

1.2.2.1睪丸精子的提取

TESA：局部麻醉后以22G針頭連接20 mL注射器經(jīng)皮穿刺睪丸，負壓吸引獲得少量睪丸組織，將抽吸的睪丸組織放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培養(yǎng)皿中，25G注射針將睪丸組織機械割成較小的碎塊，在200倍顯微鏡下尋找精子。TESE：局部麻醉后用小剪刀在睪丸白膜上剪開約0.3 cm小口，輕輕擠壓睪丸，剪下適量睪丸組織(約5 mm×5 mm)，將切下的睪丸組織放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培養(yǎng)皿中，用兩根25G注射針將睪丸組織機械割成較小的碎塊，在200倍顯微鏡下尋找精子。Mic-TESE：全身麻醉后順次切開陰囊皮膚、睪丸鞘膜，擠出睪丸，沿睪丸赤道面切開睪丸白膜(約2/3周)，掰開睪丸，在手術(shù)顯微鏡(放大15左右倍)下逐個睪丸小葉中尋找粗大、飽滿的曲線精管，剪下曲線精管放入盛有洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)的培養(yǎng)皿中，用兩根25G注射針將睪丸組織機械割成較小的碎塊，在200倍顯微鏡下尋找精子。

1.2.2.2精子的處理

TESA/TESE/Mic-TESE所獲得的睪丸組織經(jīng)處理鏡檢發(fā)現(xiàn)精子后，將含有睪丸組織的洗精受精液(G-IVFTM PLUS，瑞典Vitrolife公司)3 000×g離心5 min，棄上清液，留沉淀及約20 μL培養(yǎng)液，吹打混均，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后用于ICSI治療。

1.2.2.3行ICSI后剩余精子的冷凍保存

在室溫下將精子冷凍液等體積成滴地加入含精子的培養(yǎng)液中，每加1滴要充分混勻，室溫下放置10 min；將以上混合液轉(zhuǎn)移到已標明夫妻姓名及編號的無菌冷凍管內(nèi)封口；將冷凍管懸掛在液氮面上方30 min后，投入液氮內(nèi)貯存。

1.2.3控制性卵巢刺激方案

常規(guī)采用黃體中期GnRH-a長方案進行促排周期，降調(diào)≥14 d時測定激素水平、子宮內(nèi)膜厚度和竇狀卵泡直徑，確定達到降調(diào)標準后[(內(nèi)膜厚度≤5 mm、雌二醇(E2)≤183.5 pmol/L、黃體生成素(LH)≤5 U/L、卵泡刺激素(FSH)<5 U/L、竇狀卵泡直徑均<8 mm]，應(yīng)用150～300 IU促性腺激素(Gn)啟動控制性卵巢刺激(COS)周期，并根據(jù)B超監(jiān)測的卵泡情況和血清LH、E2水平調(diào)整Gn用量，當≥3個主導(dǎo)卵泡直徑達到18 mm時，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)4 000～10 000 IU，36 h后B超引導(dǎo)下取卵。

1.2.4受精、胚胎移植和妊娠

按常規(guī)方法行ICSI后16～18 h觀察有無原核形成，以雙原核(2PN)為正常受精。分別于受精后41～43 h，61～69 h察看胚胎卵裂情況，并記錄卵裂球數(shù)目。根據(jù)卵裂球大小均勻與否及核碎片量的多少進行胚胎質(zhì)量評級[5]。新鮮周期胚胎移植均為第3天胚胎，移植后12 d檢測血清hCG水平以確定是否妊娠，移植后30 d超聲檢查，見宮腔內(nèi)有孕囊和心管搏動診斷為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、睪丸體積、血清FSH、睪酮水平、確診到取精時間，以及配偶年齡、血清基礎(chǔ)FSH、E2水平、基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者染色體異常、少數(shù)民族患者百分比比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 COS周期中臨床觀察指標比較

兩組患者COS周期中Gn使用量、hCG日E2水平、取得成熟卵數(shù)目、ICSI受精率、卵裂率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組優(yōu)質(zhì)胚胎形成率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受精率、卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎形成率比較

2.3 兩組新鮮周期胚胎移植情況比較

兩組間行新鮮周期移植的移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及移植日內(nèi)膜厚度均無明顯差異(P>0.05)；兩組胚胎著床率、臨床妊娠率和出生率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。隨訪胎兒和新生兒畸形，精液精子組中發(fā)現(xiàn)1例先天性心臟病(室間隔缺損)。

表3 兩組間新鮮胚胎移植著床率、臨床妊娠率和出生率比較

3 討 論

自從1992年ICSI應(yīng)用于男性不育患者，特別是嚴重的少弱精子癥及無精子癥患者以來，眾多研究已證實采用精液精子、附睪精子和外科取精術(shù)獲得的睪丸精子行ICSI均可使成熟卵母細胞正常受精及形成優(yōu)質(zhì)胚胎，并通過移植胚胎可使患者獲得臨床妊娠和分娩。

部分研究者認為，對隱匿性精子癥患者，采用精液精子行ICSI的結(jié)局較采用提取的睪丸精子結(jié)局好，這是因為卵母細胞的體外受精率與精子成熟度密切相關(guān)[6]。正常情況下，睪丸精子生成后需要在附睪中停留一段時間，通過精子質(zhì)膜通透性改變、精子核成熟及頂體外膜抗原分布的改變，最終獲得運動能力及受精能力。而通過外科取精術(shù)由睪丸抽吸所獲得的睪丸精子中成熟精子占比較低[7-8]，使用這樣的精子會直接影響卵子激活，從而影響正常受精。但也有部分研究者提出相反的觀點，認為隱匿性精子癥患者行ICSI治療時，采用睪丸提取的精子較精液精子可以取得更好的結(jié)局[4，9]。分析其可能的原因為隱匿性精子癥患者精液中極少量的精子在經(jīng)過泌尿生殖道時可能受污染或氧自由基損傷，而由睪丸提取的精子則不存在這些因素的影響[5，10-11]。本研究結(jié)果顯示，隱匿性精子癥患者行ICSI治療時采用精液精子的受精率為60.1%，采用提取的睪丸精子的受精率為61.2%，二者無明顯差異(P>0.05)，與TSAI等[12]和ESTEVES等[13]的研究結(jié)果相似。

一般認為，當受精卵分裂到4～8個細胞階段時受精卵mRNA開始轉(zhuǎn)錄，提示父方基因開始表達，若精子存在缺陷，父方基因表達受阻，會導(dǎo)致胚胎在5～8個細胞階段發(fā)育緩滯[14]。睪丸精子的成熟度較精液精子的成熟度低，所以部分學(xué)者認為采用睪丸精子行ICSI后的優(yōu)質(zhì)胚胎率低于采用精液精子[7]。但本研究結(jié)果顯示，采用精液精子行ICSI后的優(yōu)質(zhì)胚胎形成率明顯低于采用提取的睪丸精子行ICSI后的優(yōu)質(zhì)胚胎形成率(38.1%vs.45.2%，P<0.05)，與ALHARBI等[10]和AMBAR等[11]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果還顯示，采用提取的睪丸精子較精液精子行ICSI后的胚胎著床率、臨床妊娠率和出生率均明顯提高，與ESTEVES等[4]的研究結(jié)果相似。分析其可能的原因：睪丸提取的精子雖成熟度不及精液精子，但精子DNA損傷程度更低[11，15-17]。

本研究中行睪丸外科取精者均為在以往精液檢驗中(離心后)發(fā)現(xiàn)有活動精子，但在配偶取卵日精液中未發(fā)現(xiàn)精子的隱匿性精子癥患者?？紤]睪丸外科取精為有創(chuàng)操作，可能導(dǎo)致出血、感染及睪丸萎縮等并發(fā)癥[18]，且睪丸外科取精在隱匿性精子癥患者中的獲精率并非100%，因此，隱匿性精子癥患者行ICSI治療時放棄精液精子而采用提取的睪丸精子仍有待進一步研究證實。對于隱匿性精子癥患者在第1次采用精液精子行ICSI治療妊娠失敗后，可考慮在行第2次ICSI治療時采用提取的睪丸精子。