劉樹軍，黃 勇，林 琨，楊建宇★

（1.南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001 ；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，廣西 南寧 530199）

呼吸道感染是兒童最常見的疾病之一，其具體臨床表現(xiàn)的差異較大，可為癥狀輕微的上呼吸道感染，也可發(fā)展成比較嚴(yán)重的下呼吸道感染，嚴(yán)重時可引起呼吸衰竭，甚至致人死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有200 萬的5 歲以下兒童因呼吸道感染而死亡[2]。絕大多數(shù)的呼吸道感染都是由呼吸道病毒（Respiratory virus）引起的[3]，臨床上常見的呼吸道病毒包括甲型流感病毒（Influenza A Virus，F(xiàn)luA）、乙型流感病毒（Influenza B Virus，F(xiàn)luB）、副流感病毒Ⅰ型（Parainfluenza virus Ⅰ，PIV Ⅰ）、副流感病毒Ⅱ型（Parainfluenza virus Ⅱ，PIV Ⅱ）、副流感病毒Ⅲ型（Parainfluenza virus Ⅲ，PIV Ⅲ）、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、腺病毒（Adenovirus，ADV）等[4]。漢黃芩素（Wogonin，即5，7-二羥基-8- 甲氧基黃銅）是唇形科植物黃芩的主要活性成分之一[5]。該物質(zhì)屬于黃酮類化合物，其分子式是C16H12O5。有研究表明，漢黃芩素具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，但其是否可以用于呼吸道病毒感染的治療，仍需進(jìn)一步探究[6-10]。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接法對漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的靶點和通路進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，推測其潛在的作用機(jī)制，進(jìn)而為后續(xù)研究提供一定的科學(xué)依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 潛在靶點數(shù)據(jù)的收集

在Pubchem 網(wǎng)站以“wogonin”為關(guān)鍵詞下載漢黃芩素的3D 化合物結(jié)構(gòu)，將其上傳至PharmMapper服務(wù)器，篩選出Z ＞0 的數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Uniprot 數(shù)據(jù)庫，得到各個靶點的官方名稱（Gene Symbol），隨后利用gprofiler 網(wǎng)站將Gene Symbol 轉(zhuǎn)換為Gene ID，構(gòu)建漢黃芩素相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫。以常見呼吸道病毒為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)，建立呼吸道病毒感染靶點數(shù)據(jù)庫。利用在線韋恩圖Venny 2.1 軟件對上述兩個靶點數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交集比對，收集漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點數(shù)據(jù)。

1.2 富集分析

將獲取的潛在靶點信息輸入到生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）中進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析[11]，根據(jù)P≤0.05 對結(jié)果進(jìn)行篩選分析，隨后利用R 4.0.4 軟件對其進(jìn)行可視化處理。

1.3 “化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)富集分析的結(jié)果，將潛在作用靶點上傳至STRING 在線軟件，獲取蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信息。運用Cytoscape 3.7.1 軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理，再將化合物、通路和疾病信息導(dǎo)入軟件，以度值（degree）的大小反映節(jié)點的大小，以介數(shù)值（EdgeBetweenness）反映邊的粗細(xì)，利用軟件的Merge 功能構(gòu)建“化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡(luò)圖。利用插件CytoHubba 分析網(wǎng)絡(luò)度（Degree）值，將Degree 值較高的靶點作為潛在關(guān)鍵靶點用于分子對接。

1.4 分子對接

在PDB 數(shù)據(jù)庫下載潛在關(guān)鍵靶點的3D 結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 軟件對靶蛋白進(jìn)行去水、去除配體等修飾處理，應(yīng)用Discovery Studio 2016 軟件（簡稱DS）進(jìn)行加氫、加電荷處理，賦予ChARMm 力場，將其定義為對接受體。隨后對經(jīng)過前期處理的靶蛋白與漢黃芩素采用LibDock 方法進(jìn)行對接運算分析。

2 結(jié)果

2.1 潛在靶點數(shù)據(jù)庫的建立

利用PharmMapper 服務(wù)器將漢黃芩素與2241 個人源蛋白靶標(biāo)進(jìn)行反向?qū)?，對漢黃芩素進(jìn)行靶點預(yù)測，篩選出Z ＞0 的74 個靶點，將其校正為Gene Symbol，并轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的Gene ID。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共收集到與呼吸道病毒感染相關(guān)的靶點528個，對上述兩組靶點進(jìn)行交集比對，得到17 個漢黃芩素與呼吸道病毒的共同靶點，見圖1 和表1。

圖1 漢黃芩素與呼吸道病毒的共同靶點Venn 圖

表1 潛在靶點數(shù)據(jù)庫

2.2 GO 富集分析和KEGG 通路注釋

根據(jù)顯著性程度，GO 富集分析和KEGG 通路注釋均以P≤0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)GO 富集分析共得到75 個GO 條目，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂酰肌醇3- 激酶信號的正調(diào)控性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程（Biological process，BP）；在細(xì)胞成分（Cellular components，CC）方面主要與核漿，細(xì)胞核、胞質(zhì)等有關(guān)；在分子功能（Molecular function，MF）方面主要涉及ATP 結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性等。根據(jù)P值分別選取BP、CC、MF 排名前10 的條目，利用R 4.0.4 軟件進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖2。經(jīng)KEGG 通路注釋得到28 條主要信號通路，符合P≤0.05 的通路有23 條。主要涉及腫瘤通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路和催乳激素信號通路等，見圖3。

圖2 潛在靶點的GO 功能富集分析圖

圖3 KEGG 通路富集氣泡圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析

利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。其中藍(lán)色節(jié)點代表化合物漢黃芩素，青綠色節(jié)點代表靶點，紫色節(jié)點代表通路，節(jié)點越大表明其度值越高，邊代表它們之間的相互作用。通過插件CytoHubba 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶蛋白MAPK14 和MAPK8 在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)的比重較大，分別調(diào)控多條通路。

圖4 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子對接驗證

從PDB 數(shù)據(jù)庫下載MAPL14 和MAPK8 的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)過前期處理修飾后，通過DS 軟件利用LibDOCK方法分別將MAPK14 和MAPK8 與漢黃芩素進(jìn)行分子對接。為了更直觀地觀察MAPK14 和MAPK8 與漢黃芩素的相互作用及關(guān)鍵的氨基酸和基團(tuán)，生成了配體-蛋白互作二維平面圖，見圖5。結(jié)果顯示，漢黃芩素與MAPK14 通過氫鍵、碳?xì)滏I、π-烷基鍵等相互作用，漢黃芩素與MAPK8 通過碳?xì)滏I、π-烷基鍵相互作用，這些相互作用為化合物的結(jié)合提供了較強(qiáng)的靜電力貢獻(xiàn)。

圖5 漢黃芩素與潛在關(guān)鍵靶蛋白互作二維平面圖

3 討論

呼吸道病毒是引起呼吸道感染的主要病原體。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人們對呼吸道病毒感染的研究不斷深入[12]。目前，中藥在治療呼吸道病毒感染的臨床實踐中顯現(xiàn)出了一定的效果，其研究前景廣闊。有研究表明，漢黃芩素具有較強(qiáng)的抗病毒活性，但其具體作用機(jī)制尚不清楚[6]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析共篩選出17 個漢黃芩素抗呼吸道病毒感染潛在靶點，包括MAPK14、MAPK8、BRAF、PTPN11、MET 等，且各靶點間有一定的相關(guān)性。這說明，漢黃芩素可通過作用于多個靶點來起到抗呼吸道病毒感染的作用。此外，通過分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可通過氫鍵結(jié)合在MAPK14 蛋白A 鏈的THR106、LEU104 上，通過π- 烷基鍵結(jié)合在MAPK14 蛋白A 鏈的Ile84、Leu75 上，通過碳?xì)滏I結(jié)合在MAPK8 蛋白A 鏈的Gly33 上，通過π- 烷基鍵結(jié)合在MAPK8 蛋白A 鏈的Val40、Val158 上。這表明，漢黃芩素可穩(wěn)定地結(jié)合MAPK14、MAPK8，提示漢黃芩素可能是通過靶向MAPK14 和MAPK8 來發(fā)揮抗呼吸道病毒的作用。絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是p38MAPK 的重要成員之一，P38MAPK 家族是由 不 同 基 因 編 碼 的α(MAPK14)、β(MAPK11)、γ(MAPK12) 和δ(MAPK13) 亞型組成，所有亞型均具有較高的氨基酸同源性[13]。其中MAPK14 是最豐富、最具特征的異構(gòu)體，可參與多種生理過程和疾病[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK14 的磷酸化形式PMAPK14 是與索拉非尼耐藥相關(guān)的一種蛋白激酶，它與乙肝病毒X 蛋白的表達(dá)有關(guān)；通過敲除pMAPK14 可提高索拉非尼的治療效果，并可在乙型肝炎病毒（HBV）存在的情況下減輕對索拉非尼的耐藥性[15]。絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）又叫JNK1 或SAPK1，是MAPK 信號通路中的重要信號分子，涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等各種機(jī)制[16]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒71 型（EV71）感染未成熟樹突狀細(xì)胞（IDC）可激活JNK1/2 和p38MAPK 信號通路級聯(lián)，使其下游分子c-Jun 和c-Fos磷酸化，進(jìn)而可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌[17]。筆者推測，漢黃芩素可通過阻斷MAPK14 和MAPK8 的活化來發(fā)揮抗呼吸道病毒的作用。本研究中通過KEGG 通路富集分析和GO 分析發(fā)現(xiàn)漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點主要富集在腫瘤通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等通路，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程。PI3K-Akt 信號通路與細(xì)胞的增殖、凋亡等細(xì)胞進(jìn)程密切相關(guān)，一些病毒的入侵和復(fù)制可能與該條通路有關(guān)[17]；MAPK 信號通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和生長等功能，在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的通信中發(fā)揮著重要的作用[18]。研究表明，病毒可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號網(wǎng)絡(luò)，包括PI3K/AKT/mTOR 和ERK/MAPK[19-20]。本研究中分析得出的關(guān)鍵靶點MAPK14和MAPK8 與細(xì)胞增殖有密切的關(guān)系。

綜上所述，本研究中應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點和通路進(jìn)行了分析，并結(jié)合分子對接初步驗證了漢黃芩素與潛在關(guān)鍵靶點之間的結(jié)合活性。這揭示了漢黃芩素可通過“多靶點—多通路”的機(jī)制來起到抗呼吸道病毒感染的作用，可為后續(xù)實驗設(shè)計和深入研究提供思路和參考。