黃 婧， 周 浩,2,3， 李美霖,2， 付 強(qiáng)

(1. 廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧530004； 2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 南寧530004； 3. 廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院， 南寧530008)

鎘(cadmium，Cd)是一種有毒的重金屬元素，低劑量(0.1～1.0 mg/kg)Cd2+處理即可抑制動(dòng)植物的生長(zhǎng)繁殖[1]。植物進(jìn)化出一套調(diào)控離子平衡的機(jī)制以減小Cd2+的傷害[2-3]。首先，植物通過(guò)分泌蘋(píng)果酸、檸檬酸等物質(zhì)，與土壤中的Cd2+離子結(jié)合從而阻斷吸收[4]。其次，植物細(xì)胞壁和胼胝質(zhì)能固定Cd2+，避免其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[3]。當(dāng)Cd2+含量超過(guò)上述生理屏障的物理吸附限度，植物通過(guò)主動(dòng)代謝產(chǎn)生螯合肽PCs參與Cd2+的解毒和區(qū)室化過(guò)程[2]。植物和酵母等真核生物的主要抗鎘機(jī)制是將鎘螯合并區(qū)室化到液泡中[5-6]。

SpHMT1基因首先在裂殖酵母中被發(fā)現(xiàn)[7-8]。ABC家族(ATP-binding cassette family)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SpHMT1能將細(xì)胞質(zhì)中PCs-Cd復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡，并形成更穩(wěn)定的高分子量復(fù)合物(high molecular weight complexes)[9]。已證實(shí)在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中過(guò)表達(dá)SpHMT1能增強(qiáng)其對(duì)Cd2+的耐性[10]。盡管SpHMT1基因早被發(fā)現(xiàn)，但迄今為止在植物中仍未鑒定到其同源蛋白。近年來(lái)，很多ABC家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被證實(shí)能轉(zhuǎn)運(yùn)Cd或者PCs-Cd復(fù)合物，如擬南芥MRP/ABCC亞家族蛋白AtABCC1/2和AtABCC3[11-12]，水稻AtABCG36[13]和AtABCC9[14]等，但它們與SpHMT1同源性不高。

鎘是生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一，是已知最易在人體內(nèi)蓄積的IA級(jí)致癌物。鎘通過(guò)植物吸收進(jìn)入食物鏈最終危害人類健康。研究通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)SpHMT1基因，探索其在模式植物對(duì)鎘的耐受性及積累中的作用，對(duì)改良植物的鎘耐受性，以及通過(guò)基因工程手段降低植物地上可食用部分的鎘含量均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-0、裂殖酵母野生型菌株Sp223和Δhmt1突變體菌株LK100為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌(Escherichiacoli)克隆載體pGEM?-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司；KOD-plus TaqTM酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Toyobo公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自Takara公司；引物合成和DNA測(cè)序均由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母RNA提取

培養(yǎng)酵母至OD600=0.5，于12 000 r/min離心收集細(xì)胞，懸于400 μL AE buffer中，加入1/10體積的10%SDS和等體積酸酚。65 ℃振蕩5 min，液氮速凍后，12 000 r/min離心2 min。上清液轉(zhuǎn)至新管中，加入1/2體積酚和1/2體積氯仿，室溫放置5 min。12 000 r/min離心10 min，上清液加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH 4～5)和2.5倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃放置1 h。13 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀用70%乙醇清洗風(fēng)干，溶于20 μL DEPC處理過(guò)的水中。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增

2～3 μg總RNA，加入Oligo(dT18)0.4 μg，補(bǔ)DEPC水至13 μL，75 ℃水浴5 min，冰上冷卻。cDNA擴(kuò)增體系：5×MMLV Buffer 5 μL；dNTPs(25 mmol/L) 5 μL； RNAse inhibitor(20～40 U)1 μL； MMLV-RT(200 U) 1 μL。擴(kuò)增參數(shù)為42 ℃水浴60 min，95 ℃水浴5 min，冰浴2 min。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋2～5倍后作為待檢測(cè)模板。PCR引物序列如表1所示。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建

使用SpHMT1克隆引物，KOD-plus反應(yīng)體系擴(kuò)增得到包括5′-UTR在內(nèi)的SpHMT1全長(zhǎng)cDNA，同時(shí)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到以高等植物保守Kozak序列替代酵母5′-UTR的全長(zhǎng)cDNA，產(chǎn)物分別克隆至pGEM T?-easy載體并測(cè)序驗(yàn)證。利用BamH I和SpeI酶點(diǎn)，將SpHMT1和Kozak-SpHMT1cDNA片段分別克隆到植物表達(dá)載體pBI121中。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[15]，獲得的T1代轉(zhuǎn)基因植物種子在添加50 μg/μL卡那霉素的1/2× MS平板上篩選陽(yáng)性苗，后續(xù)試驗(yàn)使用目標(biāo)基因單拷貝插入的T3代純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行。

1.2.5 亞細(xì)胞定位

利用BglII和XhoI酶點(diǎn)，將SpHMT1cDNA連入植物瞬時(shí)表達(dá)載體pMON530，使EYFP在基因5′端融合表達(dá)。利用PEG介導(dǎo)法將載體轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體[16]，并通過(guò)共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，LSM 510 Meta)觀察熒光信號(hào)。

1.2.6 金屬元素含量測(cè)定

10～20 mg烘干的植物材料，置于14 mL FalconTM管中，加入1 mL硝酸(MOS級(jí))，浸泡過(guò)夜。99 ℃煮30 min，樣品冷卻至室溫，補(bǔ)充Milli-Q水至14 mL。采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS，ELAN DRC-e，Perkin-Elmer)測(cè)定樣品金屬元素含量。

1.2.7 元素原位分析

擬南芥野生型Col-0和轉(zhuǎn)基因植株在含10 μmol/L CdCl2的1/2× MS平板上垂直培養(yǎng)10 d后，用取樣器取葉進(jìn)行高壓冷凍和冷凍替代[17]，環(huán)氧樹(shù)脂包埋冷凍組織，使用超薄切片機(jī)(Leica Ultracut UCT ultramicrotome)切成100 nm薄切片，并置于銅網(wǎng)上。在電鏡(Philips，CM12)上采用EDX分析元素，委托復(fù)旦大學(xué)電鏡室完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpHMT1基因的克隆和載體構(gòu)建

構(gòu)建包含酵母本身5′-UTR(標(biāo)記為HMT1)和以高等植物保守kozak序列替代酵母5′-UTR(標(biāo)記為KHMT1)的兩個(gè)載體，并分別轉(zhuǎn)入缺失SpHMT1基因的酵母突變體LK100中。如圖1所示，在CdCl2脅迫下，轉(zhuǎn)化空載體的LK100(V/LK100)生長(zhǎng)受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)化SpHMT1的突變體(HMT1/LK100)在200 μmol/L CdCl2平板上仍能正常生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化Kozak-SpHMT1的突變體(KHMT1/LK100)生長(zhǎng)性能較HMT1/LK100略差[圖1(a)]。濃度梯度Cd2+脅迫下的酵母生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果類似[圖1(b)]，說(shuō)明SpHMT1和Kozak-SpHMT1均能互補(bǔ)Δhmt1突變體的Cd2+敏感表型。

圖1 SpHMT1基因互補(bǔ)酵母Δhmt1突變體對(duì)Cd2+敏感性Figure 1 SpHMT1 complemented the Cd2+ sensitivity of Δhmt1 mutant in yeast

2.2 SpHMT1基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)

將包含Kozak序列的SpHMT1基因構(gòu)建入植物表達(dá)載體pBI121并轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-0，篩選得到兩個(gè)獨(dú)立株系(W2-11和W7-3)。RT-PCR分析表明，SpHMT1基因在擬南芥中成功表達(dá) [圖2(a)]，并且轉(zhuǎn)基因植物與野生型Col-0的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異[圖2(b)]。

Col-0代表野生型擬南芥；W2-11和W7-3分別代表SpHMT1轉(zhuǎn)化Col-0后獲得的兩個(gè)獨(dú)立的T3代純合株系。圖2 SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定及表型分析Figure 2 Identification and phenotypic analysis of SpHMT1 transgenic Arabidopsis

2.3 SpHMT1在擬南芥中的亞細(xì)胞定位

如圖3所示，EYFP對(duì)照轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后，在整個(gè)細(xì)胞中都能觀察到綠色熒光信號(hào)；而轉(zhuǎn)化EYFP-SpHMT1-pMON530載體的原生質(zhì)體，雖然綠色熒光信號(hào)稍弱，但是可以觀察到清晰的液泡膜定位。結(jié)果表明，SpHMT1在擬南芥中的亞細(xì)胞定位與酵母類似，位于液泡膜上。

上：轉(zhuǎn)化EYFP對(duì)照載體的擬南芥原生質(zhì)體；下：轉(zhuǎn)化EYFP-SpHMT1-pMON530載體的擬南芥原生質(zhì)體。左：明場(chǎng)圖像；中：綠色熒光圖像；右：綠色與紅色熒光融合圖像。Bar=20 μm。圖3 SpHMT1在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Figure 3 Subcellular localization of SpHMT1 in Arabidopsis protoplast

2.4 SpHMT1基因增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd2+等重金屬的耐性和積累

將轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子垂直培養(yǎng)于添加不同重金屬的1/4×MS平板上，分析其對(duì)Cd2+等重金屬離子的耐性。結(jié)果表明，在50 μmol/L CdCl2[圖4(a)]、150 μmol/L KH2AsO4[圖4(b)]、40 μmol/L CuSO4[圖4(c)]和150 μmol/L ZnSO4[圖4(d)]的金屬離子環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株的鮮重[圖4(e)]和主根長(zhǎng)度[圖4(f)]均顯著高于野生型對(duì)照。ICP-MS分析表明，轉(zhuǎn)基因株系中相應(yīng)的重金屬含量也顯著高于對(duì)照[圖4(g)]。結(jié)果說(shuō)明，SpHMT1基因的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd2+、Cu2+、Zn2+和As等重金屬的耐性和積累。

(a)～(d)分別為SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在添加50 μmol/L CdCl2(a)、150 μmol/L KH2AsO4(b)、40 μmol/L CuSO4(c)和150 μmol/L ZnSO4(d)時(shí)的1/4×MS平板上生長(zhǎng)4周的表型；(e)擬南芥植株的鮮重測(cè)定；(f)擬南芥植株的主根長(zhǎng)度測(cè)定；(g)擬南芥植株中的重金屬含量測(cè)定。采用Student's t test進(jìn)行差異顯著性分析。** 表示P<0.01。圖4 SpHMT1基因增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd2+等重金屬的耐性和積累Figure 4 Enhanced metal tolerance and accumulation in SpHMT1 transgenic plants

2.5 BSO抑制SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Cd2+的耐性和積累

PCs-Cd被認(rèn)為是HMT1的底物[10]。BSO能抑制GSH的合成，從而也能抑制以GSH為底物的PCs的合成[18]。為進(jìn)一步研究SpHMT1在擬南芥中的作用是否與轉(zhuǎn)運(yùn)PCs-Cd有關(guān)，用BSO對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行處理。如圖5所示，在添加0.5 mmol/L BSO平板上垂直培養(yǎng)20 d后，轉(zhuǎn)基因株系的表型、鮮重和根長(zhǎng)均與野生型類似[圖5(a)和(c)～(d)]。在同時(shí)添加10 μmol/L CdCl2和0.5 mmol/L BSO的1/4×MS平板上，轉(zhuǎn)基因株系的表型和鮮重與對(duì)照類似，植株葉發(fā)黃、萎蔫，根生長(zhǎng)也受到明顯抑制[圖5(b)～(d)]。轉(zhuǎn)基因擬南芥中的Cd2+積累量與野生型無(wú)顯著差異[圖5(e)]。水培4周苗以10 μmol/L CdCl2和0.25 mmol/L BSO 處理3 d后，其根、莖和蓮座葉中的Cd2+濃度均與對(duì)照無(wú)顯著差異[圖5(f)]。結(jié)果表明SpHMT1轉(zhuǎn)基因植物對(duì)Cd2+的耐性和積累受到BSO的抑制，說(shuō)明SpHMT1在擬南芥中的作用與PCs合成有關(guān)。

(a)(b)分別為SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型在添加0.5 mmol/L BSO，以及添加10 μmol/L CdCl2和0.5 mmol/L BSO的1/4×MS平板上垂直生長(zhǎng)4周的表型；(c)擬南芥植株的鮮重測(cè)定；(d)擬南芥植株的主根長(zhǎng)度測(cè)定；(e)擬南芥植株的Cd2+含量測(cè)定；(f)水培4周擬南芥的Cd2+含量測(cè)定。采用Student’s t test進(jìn)行差異顯著性分析。圖5 BSO抑制SpHMT1轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd2+的耐性和積累 Figure 5 BSO aborted the Cd2+ tolerance and accumulation of SpHMT1 transgenic plant

2.6 EDX檢測(cè)元素分布

利用EDX對(duì)Cd等元素的亞細(xì)胞分布進(jìn)行直接檢測(cè)。如圖6所示，在10 μmol/L CdCl2平板上生長(zhǎng)10 d的轉(zhuǎn)基因植株和野生型Col-0中未能觀察到Cd的峰，可能是由于單片葉子中積累的Cd2+含量較低或?qū)嶒?yàn)技術(shù)不成熟導(dǎo)致Cd2+流失。但是在轉(zhuǎn)基因植株中，硫(S)元素大部分在液泡中積累；而野生型擬南芥Col-0中S元素則主要積累于細(xì)胞質(zhì)。這一結(jié)果從側(cè)面說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因植物中可能有更多的Cd2+被轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡，并與S形成高分子量復(fù)合物儲(chǔ)存其中，SpHMT1的液泡膜定位結(jié)果(圖3)支持該推論。

(a)(b)分別為野生型擬南芥Col-0和SpHMT1轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)細(xì)胞的透射電鏡圖(箭頭所示為進(jìn)行X射線能量色散譜的采樣點(diǎn))；(c)(d)分別為野生型Col-0液泡和細(xì)胞質(zhì)中的EDX元素分析光譜；(e)(f)分別為SpHMT1轉(zhuǎn)基因植物液泡和細(xì)胞質(zhì)中的EDX元素分析光譜。X射線能量色散譜中包括：Cu Lα(0.923 KeV)、Al Kα(1.487 KeV)、Si Kα(1.74 KeV)、P Kα(2.014 KeV)、S Kα(2.308 KeV)和Cd Lα(3.134 KeV)等。箭頭所示為S的峰。圖6 SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型Col-0相比在液泡中積累更多的硫元素Figure 6 SpHMT1 transgenic plant accumulated more S in vacuoles than wild-type Col-0

2.7 SpHMT1基因延遲Cd2+的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)

為研究SpHMT1對(duì)Cd2+長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，分析CdCl2時(shí)間梯度處理下Col-0及轉(zhuǎn)基因植物根、莖和葉中的Cd2+含量。10 μmol/L CdCl2處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植物根中的Cd2+濃度顯著高于對(duì)照，而地上部分含量則顯著較低[圖7(a)]。處理3 d后，除根部外，轉(zhuǎn)基因植物葉中Cd2+的積累也顯著高于對(duì)照，而莖中仍比野生型低[圖7(b)]。處理7 d后，轉(zhuǎn)基因植物莖中的Cd2+濃度也顯著高于對(duì)照[圖7(c)]。這些結(jié)果說(shuō)明SpHMT1增加了整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中的Cd2+含量，并且延遲了重金屬Cd2+從根到莖的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)。

(a)～(c)分別為4周的水培擬南芥野生型Col-0及SpHMT1轉(zhuǎn)基因植物(W2-11和W7-3)，以10 μmol/L CdCl2分別處理1、3和7 d。分根(R)、莖(S)和蓮座葉(L)取材并檢測(cè)其中Cd2+含量。采用Student’s t test進(jìn)行差異顯著性分析。* 表示P<0.05，** 表示P<0.01。圖7 SpHMT1延遲Cd2+從根到莖的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)Figure 7 SpHMT1 delayed the long-distance Cd2+ transport from roots to shoots

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，鎘等重金屬污染日益嚴(yán)重，為限制重金屬通過(guò)植物吸收進(jìn)入食物鏈，研究植物對(duì)重金屬鎘等的解毒和積累機(jī)制具有非常重要的意義[3]。SpHMT1是首先在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的能跨液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)PCs-Cd復(fù)合物的重金屬耐受因子基因[7-8,19]，將SpHMT1在大腸桿菌和釀酒酵母中過(guò)表達(dá)，能增強(qiáng)Cd2+的耐性[10]。線蟲(chóng)(CaenorhabditisElegans)[20]和果蠅(Drosophila)[21]等物種中也發(fā)現(xiàn)了SpHMT1同源基因；然而近30年在植物中仍未找到其類似功能的同源蛋白。從生物技術(shù)的角度看，植物中是否具有其同源蛋白并不重要，重要的是SpHMT1能否在植物中起作用。研究在擬南芥中過(guò)表達(dá)SpHMT1基因，能增強(qiáng)其對(duì)Cd2+等重金屬的耐性和積累(圖4)。SpHMT1在擬南芥中定位于液泡膜(圖3)，并且能顯著增加野生型擬南芥液泡中S的積累(圖6)。BSO能同時(shí)抑制SpHMT1介導(dǎo)的Cd2+耐性和積累(圖5)，暗示SpHMT1在擬南芥中介導(dǎo)Cd2+液泡區(qū)室化的功能依賴于PCs。

重金屬污染對(duì)環(huán)境造成威脅，植物修復(fù)被認(rèn)為是有望解決這一問(wèn)題的重要方式，但在遭受大范圍復(fù)合型重金屬污染的地區(qū)中收效不大[22]。因此，控制鎘等有毒重金屬進(jìn)入植物的可食用部位或許是更為可行的辦法。在Cd2+長(zhǎng)時(shí)間處理后，盡管SpHMT1轉(zhuǎn)基因擬南芥地上和地下部分Cd2+的積累均增加，但是它延遲了Cd2+從根到莖的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)(圖7)，暗示根能作為儲(chǔ)存重金屬的“庫(kù)”，將PCs-Cd2+復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入根的液泡或能降低植物地上可食用部分Cd等有毒重金屬的含量。因此，SpHMT1特異性的表達(dá)于水稻等作物的地下部分，對(duì)降低谷粒中有毒重金屬的含量，保障食品安全將具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

研究在模式植物擬南芥中成功過(guò)表達(dá)裂殖酵母SpHMT1基因，發(fā)現(xiàn)其不僅能增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd2+等重金屬的耐受性和積累，還能延遲Cd2+向地上部分的長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)。SpHMT1等能跨液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)PCs-Cd復(fù)合物的重金屬耐受因子基因的應(yīng)用可作為潛在的解決糧食作物重金屬安全問(wèn)題的有效方法之一。