胡靜平， 王 燕， 傅煜軒

(1. 蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院， 蘇州215123； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院, 蘇州215001)

腸道病毒71型(EV71)是一種非包膜、單鏈正義RNA病毒，屬于微小RNA病毒科，是引發(fā)兒童手足口病(HFMD)的最主要病原體[1-2]。手足口病近年來在亞太地區(qū)廣泛流行[3]。研究證實(shí)93%的手足口病死亡與EV71感染有關(guān)[4]。少數(shù)患者可發(fā)生無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎，進(jìn)展迅速可導(dǎo)致死亡。目前并沒有針對EV71病毒的特效抗病毒治療方法，而EV71病毒的致病機(jī)制仍存在很多未知。

MicroRNAs(miRNAs)是一類較短的、高度保守的非編碼RNA，由17～25個核苷酸組成，通過與mRNAs的3′非翻譯區(qū)(3′-UTRs)的靶位點(diǎn)相互作用來抑制靶基因的表達(dá)[5]。大量證據(jù)表明miRNAs是病毒入侵和復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[6-8]。許多miRNAs已被報道參與病毒復(fù)制過程[9]，例如，HIV-1衣殼結(jié)合宿主因子cPSF6在轉(zhuǎn)錄后受到細(xì)胞miR-125b的調(diào)控[10]。MicroRNA-135a通過下調(diào)宿主抗病毒因子調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒基因組復(fù)制[11]。已有一些研究表明，宿主細(xì)胞中的miRNAs能夠參與調(diào)控EV71的感染或復(fù)制。例如：EV71病毒通過調(diào)控宿主胞內(nèi)miR-21的表達(dá)進(jìn)而影響靶基因MyD88和IRAK1的表達(dá)，從而抑制宿主細(xì)胞的I型干擾素的產(chǎn)生[12]；MiR-545通過靶向抑制PTEN和TRAF6蛋白表達(dá)從而促進(jìn)EV71病毒復(fù)制[13]；MicroRNA-302家族通過靶向KPNA2下調(diào)EV71誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答[14]。這些發(fā)現(xiàn)都提示宿主細(xì)胞內(nèi)的miRNA與EV71病毒的相互作用能夠?yàn)榭共《痉矫嫣峁┬碌牟呗浴榱藢ふ抑委烢V71相關(guān)疾病有效的miRNA，還需要進(jìn)一步研究miRNA與EV71感染之間相互作用的具體分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和病毒

Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)、SW480細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、293T細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)均來自美國ATCC細(xì)胞庫，在Dulbecco改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco)中添加10%熱滅活胎牛血清(Gibco)，37 ℃，5% CO2。EV71(腸道病毒71型)由江蘇省疾病預(yù)防控制中心饋贈。病毒溶液經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后，保存于-80 ℃冰箱中。病毒滴度由Reed-Münch終點(diǎn)計算方法確定[15]。

1.2 熒光定量PCR

使用Trizol試劑(Thermo Scientific)根據(jù)說明書進(jìn)行細(xì)胞RNA提取。用primerscript RT試劑盒(Takara)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)樣本數(shù)目按照說明書混合ABI SYBR Green Master Mix試劑，每管分別加入1 μL cDNA產(chǎn)物，在ABI 7500實(shí)時定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時定量 PCR，反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共計40個循環(huán)。每個基因做3個復(fù)孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，用DDCt法分析相對表達(dá)。miR-200b和U6引物購自RiBo生物技術(shù)有限公司(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，miR-200b表達(dá)以內(nèi)源性U6 snRNA作為對照，IFN-β和EV71 vp1 RNA的表達(dá)以內(nèi)源性GAPDH作為對照，目的基因相對表達(dá)量通過公式計算和分析，PCR引物序列見表1。

1.3 MicroRNA 轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)至細(xì)胞融合密度達(dá)到50%左右。根據(jù)說明書使用Lipofectamine 3000(Life Technologies，USA)將microRNA mimics或inhibitor(最終濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。miR-200b mimics、mimic陰性對照(mimic-NC)、miR-200b inhibitor和inhibitor陰性對照(inhibitor-NC)均購自銳博生物技術(shù)有限公司。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印記

將裂解的細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，USA)，并進(jìn)行一抗、二抗孵育，結(jié)果通過Image J軟件進(jìn)行密度分析量化。使用的一抗為抗VP1抗體(Milipore，USA)、IFIT5抗體、GAPDH抗體(Proteintech，武漢)。

1.5 熒光素酶檢測

從人類基因組DNA上PCR擴(kuò)增IFIT5的3′UTR(核苷酸1212-1219)，通過XhoI和XbaI位點(diǎn)(引物正向：5′-TCCTTCTTGGGTTCCT-3′；反向：5′- GAGGAGTCCAAATGCAAACTGG-3′)插入pmirGLO熒光素酶載體，構(gòu)建野生型IFIT5 3′報告質(zhì)粒，同時突變IFIT5 3′UTR通過PCR方法誘導(dǎo)點(diǎn)突變。293T細(xì)胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染含有IFIT5 3′-UTR和miR-200b mimics或mimic-NC的熒光素酶報告質(zhì)粒。48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌一次，用裂解緩沖液(Promega)裂解。15 min后收集上清液，12 000 r/min離心5 min。用雙熒光素酶報告檢測試劑盒(Promega)測定熒光素酶活性。

1.6 免疫熒光

細(xì)胞感染后用3.7%多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100室溫通透，依次用一抗和熒光二抗孵育，DAPI染料(碧云天，中國)用于細(xì)胞核染色。樣品在激光共聚焦顯微鏡下觀察并用成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行分析(Olympus,日本)。

1.7 small RNA文庫制備與miRNA測序

將感染及未感染EV71的細(xì)胞提取總RNA，每個樣品取2 μg 總RNA進(jìn)行small RNA文庫構(gòu)建。所有總RNA的RIN值都在8.0以上。根據(jù)Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit(Illumia，USA)的操作說明分別選取不同的index標(biāo)簽建庫。使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)試劑在cBot上生成簇。之后在Hiseq 4000測序平臺上運(yùn)行單端測序程序 (SE50)，得到50 bp的單端測序reads。對各個樣本中miRNA進(jìn)行表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計，通過TPM進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理，之后用DEGseq進(jìn)行差異分析，將差異miRNA篩選條件設(shè)置為Pvalue<0.01，|log2(fold change)|>1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EV71感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)上升

通過高通量測序檢測microRNA在EV71感染SW480細(xì)胞中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)EV71感染SW480細(xì)胞24 h后，在所有統(tǒng)計差異變化的microRNA中，has-miR-200b變化最為顯著[圖1(a)和(b)]；目前對miR-200b在EV71感染中的功能和作用未有報道。qRT-PCR進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)miR-200b的表達(dá)在EV71感染SW480細(xì)胞中不同時間點(diǎn)逐漸上升，18 h時達(dá)到峰值后不再變化[圖1(c)]；另外，不同MOI的病毒劑量感染SW480細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞(MOI=0)相比，miR-200b的表達(dá)量隨病毒劑量的提高而逐漸升高，當(dāng)MOI=2時達(dá)到峰值后，不再隨病毒劑量升高而增加[圖1(d)]。

(a)在MOI=1條件下，EV71感染SW480細(xì)胞24 h時高通量測序分析結(jié)果；(b)高通量測序結(jié)果中升高倍數(shù)最高的top10 miRNA；(c)和(d)分別為用實(shí)時定量PCR定量分析EV71感染的SW480細(xì)胞不同時間點(diǎn)和不同病毒劑量后，細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)水平。* 表示P<0.05,** 表示P<0.01;*** 表示P<0.001。圖1 在SW480細(xì)胞中，EV71感染上調(diào)miR-200b的表達(dá)Figure 1 EV71 infection in SW480 cells upregulates miR-200b expression

2.2 抑制miR-200b表達(dá)能夠抑制EV71病毒復(fù)制

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-200b對EV71復(fù)制的影響，將miR-200b inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染 SW480細(xì)胞24 h后，給予EV71感染24 h，檢測病毒VP1的表達(dá)水平[圖 2(a)]，結(jié)果顯示，與對照組或inhibitor-NC相比，miR-200b阻斷可抑制EV71 VP1蛋白的表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了一致的結(jié)果，與陰性對照相比，抑制miR-200b的表達(dá)，HeLa細(xì)胞內(nèi)EV71 VP1 蛋白表達(dá)顯著降低[圖 2(b)]。因此，阻斷miR-200b可以抑制EV71的復(fù)制。

(a)轉(zhuǎn)染miR-200b inhibitor或inhibitor-NC的SW480細(xì)胞感染EV71病毒后， Western Blot分析VP1表達(dá)水平；(b)免疫熒光法檢測VP1蛋白表達(dá)。*** 表示P<0.001。圖2 抑制miR-200b能抑制EV71復(fù)制Figure 2 Inhibition of miR-200b suppress EV71 replication

2.3 miR-200b能夠靶結(jié)合IFIT5并抑制其表達(dá)

為探討miR-200b調(diào)控EV71感染的分子機(jī)制，利用在線TargetScan軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析(www.targetscan.org)，在預(yù)測的下游靶點(diǎn)中，IFIT5是miR-200b的潛在靶點(diǎn)之一[圖 3(a)]，IFIT5具有調(diào)節(jié)I型干擾素的功能，在抗病毒免疫中有重要作用[16]。為了證實(shí)IFIT5和miR-200b之間的相互作用，構(gòu)建了含有野生型或突變型IFIT5 3′UTR序列的熒光素酶報告載體，并測定了其與miR-200b mimics或mimic-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時的熒光素酶活性，如圖 3(b)所示，與陰性對照相比，miR-200b mimics顯著降低了293T細(xì)胞中含有野生型IFIT5 3′-UTR的報告基因的相對熒光素酶活性。相比之下，突變的IFIT5 3′UTR報告載體中的熒光素酶活性沒有顯示出顯著的變化[圖 3(b)]，這表明miR-200b靶位點(diǎn)在IFIT5 3′UTR中為1212-1219。同時，過表達(dá)miR-200b會抑制IFIT5蛋白表達(dá)，而抑制內(nèi)源性miR-200b，則會增加IFIT5蛋白表達(dá)[圖 3(c)]，表明miR-200b介導(dǎo)的IFIT5下調(diào)具有特異性。

(a)用TargetScan預(yù)測has-miR-200b結(jié)合位點(diǎn)(IFIT5 3′UTR及其突變位點(diǎn))；(b)熒光素酶報告基因檢測，共轉(zhuǎn)染含有has-miR-200b靶位點(diǎn)(wt-IFIT5 3′-UTR)或相應(yīng)突變體(mt IFIT5 3′-UTR)的熒光素酶報告載體和miR-200b mimics或mimic-NC的293T細(xì)胞；(c)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200b mimics、miR-200b inhibitor或陰性對照。24 h后，收集293T細(xì)胞，一抗：IFIT5和GAPDH抗體，EV71感染24 h，MOI=1。*** 表示P<0.001。圖3 miR-200b能夠靶結(jié)合IFIT5并抑制其表達(dá)Figure 3 miR-200b can target IFIT5 and inhibited its expression

2.4 miR-200b通過靶結(jié)合IFIT5進(jìn)而抑制干擾素應(yīng)答

IFIT5為重要的干擾素刺激基因，為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-200b是否能夠通過靶向IFIT5來調(diào)節(jié)I型干擾素的表達(dá)，檢測在IFN-β處理下，EV71感染SW480細(xì)胞后miR-200b的表達(dá)。熒光定量PCR分析顯示，與陰性對照組相比，IFN-β的存在降低了miR-200b的水平[圖 4(a)]。接著又檢測了在miR-200b mimics或mimic-NC存在下，EV71感染SW480細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)。熒光定量PCR分析顯示miR-200b的過表達(dá)降低了IFN-β的表達(dá)水平[圖 4(b)]。另外，通過抑制細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)后再給予EV71病毒感染，通過ELISA檢測細(xì)胞上清液中IFN-β水平發(fā)現(xiàn)，在miR-200b被抑制的狀態(tài)下，EV71病毒的感染會導(dǎo)致更多的IFN-β釋放[圖 4(c)]。這些結(jié)果表明miR-200b通過靶結(jié)合IFIT5進(jìn)而抑制干擾素應(yīng)答。

(a)在IFN-β(1 000 U)存在下，EV71感染SW480細(xì)胞，熒光定量PCR檢測miR-200b mRNA水平；(b)EV71感染miR-200b mimics或mimic-NC轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞，實(shí)時定量PCR檢測IFN-βmRNA水平；(c)ELISA檢測在miR-200b表達(dá)被抑制下EV71病毒感染后的細(xì)胞上清液IFN-β的表達(dá)量。** 表示P<0.01;*** 表示P<0.001。圖4 miR-200b通過靶向IFIT5抑制I型干擾素應(yīng)答Figure 4 miR-200b inhibit the type I interferon response by targeting IFIT5

3 討論與結(jié)論

EV71感染可引起一系列影響，從無癥狀感染到輕度手足口病，再到嚴(yán)重并發(fā)癥，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肺衰竭，嚴(yán)重者死亡率高達(dá)82%～94%[17]。然而EV71感染的分子機(jī)制尚有很多未知，而且有效的治療方法尚未開發(fā)出來。

MiRNAs在EV71病毒復(fù)制中起著重要作用，越來越多的證據(jù)表明，許多細(xì)胞MiRNAs參與了EV71感染和發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)，如miR-545[13]、miR-146a[18]、miR-494-3p[19]、miR-21[12]和miR-124[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在EV71感染的SW480細(xì)胞中miR-200b表達(dá)水平升高。據(jù)報道，miR-200b是miR-200家族的重要成員。miR-200家族的成員已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)，研究表明miR-200b通過抑制c-Jun/MAPK通路降低活化小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[21]，為了進(jìn)一步研究miR-200b在EV71復(fù)制中的作用，用miR-200b抑制劑下調(diào)HeLa細(xì)胞miR-200b水平，發(fā)現(xiàn)阻斷miR-200b可以抑制EV71的復(fù)制。

為進(jìn)一步研究機(jī)制，利用在線miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan對miR-200b的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)IFIT5基因是miR-200b的靶點(diǎn)。IFITs是由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的含TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白,在機(jī)體抗病毒過程中起著關(guān)鍵作用[22-23]。IFIT5是一種干擾素調(diào)節(jié)因子，研究表明IFIT5在抗病毒反應(yīng)中具有潛在作用[24]。我們發(fā)現(xiàn)miR-200b的過表達(dá)或內(nèi)源性miRNA-200b的抑制分別導(dǎo)致IFIT5表達(dá)的抑制或增加，結(jié)果表明miR-200b介導(dǎo)的IFIT5下調(diào)具有特異性，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-200b的過表達(dá)會降低IFN-β的表達(dá)水平。

綜上所述，EV71病毒感染能夠上調(diào)miR-200b表達(dá)，進(jìn)而抑制IFIT5基因表達(dá)，導(dǎo)致胞內(nèi)干擾素應(yīng)答抑制，從而有利于EV71病毒復(fù)制。結(jié)果為miR-200b在EV71病毒感染過程中的作用提供了一個新的機(jī)制，調(diào)控miR-200b的表達(dá)可能是應(yīng)對EV71感染的一種潛在治療策略。