田旭靜，崔小芳

（1.山西鐵道職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030013；2.山西錦爍生物醫(yī)藥科技有限公司，山西 晉中 030600）

藜麥?zhǔn)且环N原產(chǎn)于南美洲安第斯中高海拔山區(qū)的藜科藜屬植物，具有相當(dāng)全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此被賦予“營(yíng)養(yǎng)黃金”的稱號(hào)[1]。至今，藜麥已有幾千年的種植和食用歷史，藜麥不僅具有高蛋白，還富含對(duì)人體健康有利的多酚、皂苷、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被推薦為全谷全營(yíng)養(yǎng)食品[2]。藜麥的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)受氣候、土壤、種植條件等因素的影響，目前在山西、四川、陜西等地廣泛種植。

蘆丁是維生素P屬的一類黃酮類化合物，可以通過清除氧自由基，進(jìn)而對(duì)油脂過氧化作用產(chǎn)生明顯的抑制作用，可用作開發(fā)新型食用油脂[3]。蘆丁可以改善血管的功能，維持毛細(xì)血管的彈性，使血管的脆性和通透性降低，醫(yī)學(xué)上可降低高血壓、糖尿病、視網(wǎng)膜出血等一系列疾病的發(fā)生率。目前可以采用比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等來(lái)測(cè)定蘆丁的含量，其中效率最高、應(yīng)用最廣的方法是高效液相色譜法[4]。

高效液相色譜法（HPLC）是一種重要的分離檢測(cè)技術(shù)，已作為食品、藥品檢驗(yàn)的重要方法之一。HPLC是采用高壓輸液系統(tǒng)，將流動(dòng)相注入系統(tǒng)，樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)隨流動(dòng)相進(jìn)入分離系統(tǒng)，樣品中各組分由于極性不同，在分離系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)分離，依次進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)在相應(yīng)條件下得到不同的響應(yīng)值，依據(jù)響應(yīng)值對(duì)樣品中各組分進(jìn)行定量分析。流動(dòng)相可以為多種溶液按照規(guī)定的比例制作為混合溶液，也可以使用單一溶液的方式。分離系統(tǒng)有色譜柱和控溫組成。HPLC技術(shù)和傳統(tǒng)的色譜檢驗(yàn)方法相比，具有檢測(cè)自動(dòng)化水平高，分析速度快、精度高的優(yōu)勢(shì)，精度能夠達(dá)到0.01 ng，所以在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域價(jià)值高[5]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定藜麥中的蘆丁含量，并對(duì)此方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步提取蘆丁原料和篩選蘆丁含量高的藜麥種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ASl0200AT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯；Vanquish Core（VWD）高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；MILLIPORE超純水器（美國(guó)密理博公司），電子分析天平（德國(guó)賽多利斯CP-224S）。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，純度98.%），甲醇為色譜純，超純水，山西忻州靜樂縣藜麥。

1.3 色譜條件

采用Agela Technologies Venusil ABS C18柱，流動(dòng)相為乙腈-水（2∶8），采用梯度洗脫，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，進(jìn)樣量20μL。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用天平準(zhǔn)確稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于量瓶中，加入甲醇溶液進(jìn)行溶解，然后稀釋定容至25 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度為400μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取適量?jī)?chǔ)備液稀釋成2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、35μg·mL-1、60μg·mL-1、120μg·mL-1質(zhì)量濃度梯度，按前述色譜條件取20μL進(jìn)樣[6]。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜Fig.1 The standard chromatogram of rutin

1.5 樣品處理

取藜麥樣品80 g，先進(jìn)行脫殼處理，然后置于40℃烘干箱中鼓風(fēng)干燥3 h后研細(xì)，過0.25 mm篩，用天平精密稱定5.0 g，加入50 mL甲醇溶液溶解于150 mL磨口錐形瓶中，密塞搖勻，超聲提取30 min，再回流水解1.5 h，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取一定量的提取液經(jīng)0.45μm濾膜（Milipore，USA）過濾后，取20μL直接進(jìn)樣[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列從低濃度到高濃度進(jìn)行排序，根據(jù)試驗(yàn)方法分別進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以質(zhì)量濃度x值為橫坐標(biāo)，以峰面積Y值為縱坐標(biāo)繪制而成，見圖2。結(jié)果可見，在2～120μg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和相應(yīng)的峰面積之間線性關(guān)系保持良好。線性回歸方程為y=0.316 44x-0.068 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9[7]。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of rutin

2.2 加樣回收率試驗(yàn)

用天平準(zhǔn)確稱定藜麥樣品5 g（其中蘆丁含量為2.83μg/g）共6份，分別置于量瓶中，將蘆丁濃度為2μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液以1 mL，15 mL的標(biāo)準(zhǔn)各加入3份于6份樣品中。按照樣品測(cè)定方法進(jìn)行峰面積的測(cè)定和蘆丁含量的計(jì)算[8]。由表1可以看出，蘆丁的平均回收率為98.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.02%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The recovery test results

2.3 樣品的測(cè)定

按照上文1.5所述對(duì)樣品進(jìn)行處理，用天平精密稱取6份樣品，超聲提取后將提取液進(jìn)行過濾，分別取20μL直接進(jìn)樣。樣品1～6的蘆丁含量分別為2.76μg/g，2.81μg/g，2.74μg/g，2.84μg/g，2.88μg/g，2.71μg/g[8]。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)精密吸取5次各20μL，在1.3色譜條件下進(jìn)樣，將5次的峰面積值做好記錄，結(jié)果表明5次峰面積值的RSD為1.22%，說明儀器具有良好的精密度[6]。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

用天平準(zhǔn)確稱定藜麥樣品5.0 g共5份，對(duì)樣品處理后，進(jìn)行提取制備，從5份樣品提取液中各取20μL進(jìn)樣，進(jìn)行5次峰面積值的測(cè)定和蘆丁含量的計(jì)算，RSD為0.69%，說明本法重復(fù)性比較好[7]。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇藜麥樣品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣20μL測(cè)定，不同時(shí)間內(nèi)的峰面積值見表2。結(jié)果表明藜麥樣品中蘆丁峰面積值的RSD為0.91%，表明該樣品在12 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性[6]。

表2 藜麥中蘆丁穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The stability test results of rutin in Quinoa

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在2～120μg·mL-1范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和相應(yīng)的峰面積之間線性關(guān)系保持良好。線性回歸方程為y=0.316 44x-0.068 1，r=0.999 9，平均加樣回收率為98.33%，RSD為2.02%。其中重復(fù)性，穩(wěn)定性，精密度均能符合試驗(yàn)要求，因此本試驗(yàn)方法測(cè)定蘆丁方法可靠簡(jiǎn)便，適合于藜麥產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

在很多蘆丁測(cè)定的研究中，樣品中的蘆丁一般采用乙醇或甲醇來(lái)進(jìn)行提取[8]。本試驗(yàn)分別用乙醇和甲醇對(duì)藜麥中蘆丁進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇作為藜麥中蘆丁的提取劑效果更好，樣品的回收率、穩(wěn)定性、重復(fù)性更符合試驗(yàn)要求[9]。同時(shí)測(cè)定藜麥種質(zhì)的蘆丁含量，篩選出蘆丁含量比較高的藜麥種質(zhì)，可為后續(xù)藜麥功能育種研究提供相關(guān)依據(jù)。