陳海云，邱英華，滕麗瓊，鄭蘇華

（南寧眾冊(cè)生物科技有限公司，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530007）

柑橘黃龍?。–irtus huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)中的一種破壞性病害，主要分布在近50個(gè)國(guó)家和地區(qū)，包括亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北部地區(qū)[1]。目前，初步認(rèn)定柑橘黃龍病病原菌由限制于韌皮部的難養(yǎng)細(xì)菌（Candidatus Liberobacter）引起，該病原菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，暫時(shí)還不能人工培養(yǎng)。根據(jù)傳播媒介和病原的熱敏性及病原菌16S r DNA和β-操縱子基因的序列特征，將柑橘黃龍病菌分為非洲種、亞洲種和美洲種[2]。病原菌嚴(yán)重影響寄主韌皮部，可引起葉片黃化、果實(shí)商品價(jià)值降低、枝條枯梢和樹體死亡[3]。黃龍病的自然傳播方式主要為柑橘木虱傳播、人為傳播和菟絲子傳播等方式，傳播途徑復(fù)雜且范圍廣，防控難度大[4]。近幾年來(lái)，廣西區(qū)柑橘類水 果面積快速擴(kuò)大，根據(jù)廣西區(qū)統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，廣西柑橘種植面積60×104hm2，產(chǎn)量1 000×104t，是廣西農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在農(nóng)民脫貧致富奔小康和新農(nóng)村建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。種植面積的急速擴(kuò)大使得柑橘感染黃龍病的染病危險(xiǎn)系數(shù)大增，廣西區(qū)內(nèi)柑橘黃龍病發(fā)生面積達(dá)867 hm2，一旦出現(xiàn)重大病情，將會(huì)對(duì)廣西果業(yè)與經(jīng)濟(jì)造成沉重打擊。

柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)中的重大病害，其病原菌能夠侵染柑橘及其近緣屬植物，目前尚無(wú)有效的防治方法，仍以防控為主。通常只能采取連根挖除并燒毀染病植株的辦法，防止黃龍病菌擴(kuò)散，中斷傳染源。如能在早期發(fā)現(xiàn)、甄別黃龍病病菌，及時(shí)切斷傳染源控制黃龍病蔓延，對(duì)保障柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義，因此，研究開發(fā)一種能快速、準(zhǔn)確、安全的診斷柑橘黃龍病的檢測(cè)技術(shù)成為柑橘黃龍病防控及柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的迫切需求。

建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，對(duì)柑橘黃龍病的檢測(cè)具有重要意義。而重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增（Recombinase-acidAmplification，RAA）技術(shù)是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶,替代了PCR高溫變形循環(huán)過程，在37℃恒溫條件下快速、靈敏檢測(cè)目的基因片段[5]。具體原理為：從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA、單鏈結(jié)合蛋白緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding，SSB）的幫助下，使模板雙鏈DNA解旋，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈。單鏈結(jié)合蛋白（SSB）防止單鏈DNA復(fù)性，在能量和dNTP存在的情況下，由DNA聚合酶完成鏈的延伸，5～20 min便可完成擴(kuò)增。此外，RAA技術(shù)還能夠完成多重引物擴(kuò)增，利用不同顏色的熒光標(biāo)記，在同一個(gè)反應(yīng)里檢測(cè)到不同的目的基因[6]。

RAA技術(shù)具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：①操作簡(jiǎn)單，無(wú)需專業(yè)人員也可完成樣本的分子層面檢測(cè)；②設(shè)備便攜，能應(yīng)對(duì)各種惡劣環(huán)境，實(shí)現(xiàn)移動(dòng)執(zhí)法，抗干擾強(qiáng)；③5～15 min出檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“快檢”；④37℃～39℃的常溫恒溫反應(yīng)，無(wú)需另購(gòu)熱循環(huán)儀或其他昂貴設(shè)備；⑤靈敏度高，特異性強(qiáng)，精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)基因片段，所得結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤；⑥采取先進(jìn)的凍干技術(shù)，將其制成干粉試劑，可直接上機(jī)檢測(cè)，便于運(yùn)輸，操作更簡(jiǎn)便，避免反復(fù)凍融帶來(lái)的誤差和損耗。

本研究擬基于RAA技術(shù)建立柑橘黃龍病的檢測(cè)方法。利用RAA技術(shù)建立黃龍病菌的檢測(cè)體系，測(cè)試檢測(cè)方法的特異性和靈敏性，評(píng)價(jià)RAA在黃龍病原檢測(cè)方面的適用性。結(jié)合熒光探針建立熒光RAA反應(yīng)體系，開展敏感性及特異性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)熒光RAA在黃龍病原檢測(cè)方面的適用性。建立側(cè)流層析試紙條的AA-LFD方法，評(píng)價(jià)這種方法的靈敏度、特異性。固定試劑組分，組裝成試劑盒，進(jìn)行試劑盒靈敏度、特異性、保存方式、保質(zhì)期、穩(wěn)定性等方面的測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

植物樣品主要來(lái)自南寧各個(gè)縣區(qū)的柑橘種植園，植株葉片出現(xiàn)原因不明的黃化現(xiàn)象。陰性對(duì)照為水果站提供的健康植株。

1.2 主要生物學(xué)試劑

DNA提取試劑盒為天根生物公司高效植物基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker DL 2000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，RAA恒溫核酸快速擴(kuò)增試劑（熒光型），即RAA擴(kuò)增試劑，南寧眾冊(cè)生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)凍干。2×Taqman PCR Mix購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

Genchek RAA檢測(cè)儀購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司。TGL-16MS高速冷凍離心機(jī)為上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。Nanophotometer NP80 Touch微量紫外分光光度計(jì)為德國(guó)implen公司產(chǎn)品。

1.4 樣品核酸提取

柑橘植株總基因組的提取方法參照杭州眾測(cè)生物科技有限公司RAA基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒。將少量酒精倒入研缽，研磨棒，藥匙，后點(diǎn)燃進(jìn)行滅菌消毒，待研缽冷卻后，取少量新鮮柑橘葉脈，用剪刀剪碎后放入研缽中，一邊加入液氮一邊研磨，后續(xù)提取程序參照基因組提取試劑盒說(shuō)明書。取1μL提取的基因組DNA在超微量分光光度計(jì)上檢測(cè)樣品濃度及純度，260/280比值介于1.8～2.0。剩余樣品置于-20℃冰箱貯藏備用。

1.5 RAA引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)RAA引物設(shè)計(jì)原則，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中50S核糖體亞基 基 因 序 列（MN117984.1、MN117983.1、MG384706.1、KY990824.1、KY550699.1、MN563116.1、MN563108.1、CP010-804.2、MK542517.1、MG256971.1）保守區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)，采用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取同源性高的片段，用Primer primer5.0設(shè)計(jì)了探針及4對(duì)引物（表1）。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作為模板，根據(jù)RAA熒光型反應(yīng)對(duì)探針的要求對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，以RAA熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒對(duì)引物進(jìn)行篩選。擴(kuò)增反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為37℃、20 min。選擇擴(kuò)增效率最佳的1對(duì)引物。以上引物及探針均由北京六合華大基因科技有限公司合成，具體信息詳見表1。熒光定量PCR引物探針序列見表2。

表1 RAA引物探針序列Tab.1 The sequence of RAA primer probe

表2 熒光定量PCR引物探針序列Tab.2 The primer probe sequence of fluorescent quantitative PCR

1.6 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

以上述提取的DNA為模板進(jìn)行RAA檢測(cè)。反應(yīng)體系（50μL）：水27.4μL，20%PEG 12.5μL，上下游引物各2.0μL（引物濃度10μmol/L），探針0.6μL（探針濃度10μmol/L），DNA模版5.0μL，280 mmol/L乙酸鎂2.5μL；反應(yīng)程序：預(yù)熱階段39℃40 s，1個(gè)循環(huán)；循環(huán)階段39℃，30 s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)；熒光通道：FAM。

PCR反應(yīng)體系（25μL）：水5μL，2×Taqman PCR mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，探針0.5μL，模板5μL；反應(yīng)程序95℃10 min，循環(huán)階段為95℃15 s，60℃20 s，共45個(gè)循環(huán)。

1.7 RAA熒光反應(yīng)條件優(yōu)化

比較RAA反應(yīng)體系中PEG的終濃度為4%、4.5%、5%、5.5%、6%時(shí)的擴(kuò)增效率；比較醋酸鎂濃度在260 mmol/L、270 mmol/L、280 mmol/L、290 mmol/L、300 mmol/L時(shí)的擴(kuò)增效率，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 RAA方法的特異性測(cè)試

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、支氣管敗血波氏桿菌、Ⅱ型豬鏈球菌的參考菌株提取的DNA為模板，分別使用上述1.6反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行RAA檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的特異性。

1.9 RAA方法的靈敏度測(cè)試

50S核糖體亞基基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成克隆質(zhì)粒。將質(zhì)粒以10倍梯度進(jìn)行稀釋，濃度分別為1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。將稀釋后的質(zhì)粒分別作為質(zhì)粒靈敏度試驗(yàn)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)經(jīng)梯度稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品分別使用上述1.6反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行RAA檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的靈敏度。

1.10 樣品檢測(cè)

取1.4的提取的樣本DNA作為模板，分別使用上述的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行RAA檢測(cè)和PCR檢測(cè)，以掌握所建立方法對(duì)盲樣的檢測(cè)情況。在提取樣品或菌株DNA的過程中，分別同時(shí)提取DEPC水作為陰性對(duì)照，用以驗(yàn)證提取過程是否出現(xiàn)DNA污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAA引物篩選結(jié)果

樣品采集按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集，標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃。使用DNA快速提取試劑盒提取柑橘葉的DNA基因組，首先取柑橘葉片的主葉脈3～5條，用剪刀剪碎至1.5 mL離心管中。剪碎的樣品加入300μL的Ll裂解液，用研磨棒將葉脈盡量研碎，再加入300μL的L2裂解液，混勻，短管離心30 s，取5μL上清作為模板，直接進(jìn)行RAA擴(kuò)增。樣本檢測(cè)操作步驟：向干粉反應(yīng)管中加入42.5μL的ABuffer；向干粉反應(yīng)管中加入5.0μL經(jīng)2.4處理得到的待測(cè)樣本DNA，并同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照；再向干粉反應(yīng)管蓋中加入2.5μL的BBuffer，蓋上管蓋，上下翻轉(zhuǎn)混勻5～6次，低速離心10 s；將干粉反應(yīng)管放入Genchek系列熒光檢測(cè)儀（或其他熒光定量PCR儀）中，選擇RAA檢測(cè)程序，開始檢測(cè)。

以質(zhì)粒pUC57-50S（1×10 copies/μL）作為模板，上下游各4條引物共16種組合進(jìn)行RAA熒光反應(yīng)，得出最佳引物組合F2/R3。以質(zhì)粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作為模板，上下游各4條引物共16種組合進(jìn)行RAA熒光反應(yīng)，結(jié)果顯示，引物對(duì)F2/R3相對(duì)于其他引物對(duì)的出峰時(shí)間更早，熒光值更高（圖1），因此選用引物對(duì)F2/R3為最佳引物。

圖1 引物篩選結(jié)果Fig.1 The primer screening results

2.2 RAA熒光反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，結(jié)果顯示PEG終濃度在5%（圖2A）、醋酸鎂終濃度在280 nmol/L（圖2B）時(shí)擴(kuò)增效率最佳，與試劑盒中的反應(yīng)體系相符。

圖2 不同PEG和醋酸鎂濃度下RAA熒光反應(yīng)Fig.2 The RAA fluorescence reaction under different PEGand magnesium acetate concentrations

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用本試驗(yàn)建立的方法在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀及Genchek RAA檢測(cè)儀上對(duì)不同病原菌進(jìn)行特異性測(cè)試。結(jié)果顯示，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、支氣管敗血波氏桿菌、Ⅱ型豬鏈球菌及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，僅陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。表明所建立的RAA熒光檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The specific test results

2.4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

利用本試驗(yàn)建立的方法在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀及Genchek RAA檢測(cè)儀上進(jìn)行靈敏度測(cè)試，以熒光PCR作為對(duì)比。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。結(jié)果顯示熒光PCR法和RAA熒光法最低可檢測(cè)到10拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

圖4 PCR 7500 Genchek的靈敏度圖Fig.4 The sensitivity map of PCR 7500 Genchek

2.5 樣品檢測(cè)情況

采集的102份可疑柑橘葉樣本提取核酸后在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光熒光PCR儀及Genchek RAA檢測(cè)儀上進(jìn)行RAA熒光法的檢測(cè)。與熒光PCR法進(jìn)行對(duì)比RAA檢出率要偏高一些，實(shí)時(shí)熒光定量陽(yáng)性57份，陰性45份，陽(yáng)性率44.12%。RAA實(shí)時(shí)熒光60份樣本核酸為陽(yáng)性，42份樣本核酸為陰性，所建立的RAA熒光法在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀及Genchek RAA檢測(cè)儀上的檢測(cè)與熒光PCR檢出符合率均為97%，表明所建立的RAA熒光法配合便攜式Genchek RAA檢測(cè)儀可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的相關(guān)柑橘黃龍病檢測(cè)方法有田間診斷與指示植物檢測(cè)、碘-淀粉沉淀法，顯微鏡觀察法，血清學(xué)鑒定法等。分子生物學(xué)主方法主要有免疫學(xué)檢測(cè)、PCR法、DNA雜交法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法，但是這些技術(shù)需要專業(yè)人士操作，且步驟較繁瑣，等待時(shí)間也比較長(zhǎng)，不太適合柑橘園中進(jìn)行大規(guī)模的快速檢測(cè)[7]。針對(duì)我國(guó)柑橘黃龍病目前暫無(wú)特效藥劑防治仍需要以預(yù)防為主的現(xiàn)狀，將現(xiàn)代分子生物學(xué)核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于柑橘黃龍病的早期病菌篩查檢測(cè)中，利用英、美歸國(guó)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜開發(fā)的世界領(lǐng)先的重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)（簡(jiǎn)稱RAA技術(shù)），建立黃龍病菌的檢測(cè)體系，研發(fā)具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備便攜、檢測(cè)快速、常溫反應(yīng)、結(jié)果準(zhǔn)確等特性的柑橘黃龍病RAA檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)黃龍病早期病菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，以盡早發(fā)現(xiàn)和甄別感染病菌植株，切斷黃龍病傳染源，對(duì)柑橘黃龍病的防控及柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義，同時(shí)彌補(bǔ)了廣西柑橘黃龍病RAA檢測(cè)技術(shù)的空白，有效帶動(dòng)南寧市植物病害核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及綜合競(jìng)爭(zhēng)力的提升。同時(shí)，通過項(xiàng)目的實(shí)施，進(jìn)一步提高公司整體研發(fā)人員尤其是青年研發(fā)人員的技術(shù)水平，形成良好的研發(fā)機(jī)制及帶頭示范作用，進(jìn)一步提升公司體外診斷試劑的整體研發(fā)水平及綜合創(chuàng)新能力。

目前，RAA技術(shù)還處于初期階段，正在不斷優(yōu)化反應(yīng)溫度、時(shí)間和結(jié)果判讀方式[8]，但是對(duì)于一個(gè)剛出現(xiàn)的新技術(shù)而言，能夠在體外37℃左右的溫度下迅速擴(kuò)增出目的片段，且反應(yīng)時(shí)間僅需10～20 min，已經(jīng)是很好的成績(jī)，并已有科研單位研發(fā)出家用柑橘黃龍病分子診斷試劑盒。此外，RAA技術(shù)也是目前唯一可能研究出體內(nèi)核酸擴(kuò)增技術(shù)的后備技術(shù)。反應(yīng)結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光曲線監(jiān)控、試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）多種方式進(jìn)行快速判讀[9-11]。與其他DNA擴(kuò)增技術(shù)相比，它不需要貴重的設(shè)備，能夠在更短時(shí)間內(nèi)和較低溫度下擴(kuò)增目的DNA。傳統(tǒng)PCR和熒光PCR需要昂貴且體積較大的設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間也因核酸類別和片段大小而異，通常擴(kuò)增時(shí)間都較長(zhǎng)，常為50～150 min[10-13]。綜合以上表明，RAA技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯著，具有便攜、高效、高靈敏度、實(shí)用性廣的特點(diǎn)，且對(duì)試驗(yàn)人員操作技術(shù)要求低，實(shí)驗(yàn)所需環(huán)境和設(shè)備要求不高，尤其適合于大規(guī)模的流行病學(xué)篩查和現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

本研究所建立的RAA檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確鑒別出柑橘黃龍病。通過對(duì)方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、盲樣檢測(cè)等一系列驗(yàn)證，證明所建立的檢測(cè)方法對(duì)柑橘黃龍病病原菌具有顯著特異性。本研究基于RAA所建立的黃龍病檢測(cè)方法能夠滿足大規(guī)模果園的篩查和快速檢測(cè)，相信隨著反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，RAA法能夠利用它的優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)黃龍病方面廣泛發(fā)揮作用。