王慧 張從合 汪和廷 黃艷玲 嚴(yán) 志 管昌紅

（安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜交稻新品種創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230088）

小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，也是目前尚未大規(guī)模開展雜種優(yōu)勢(shì)利用的作物之一，雜交小麥?zhǔn)切←滊s種優(yōu)勢(shì)利用的具體形式，一般可以使小麥產(chǎn)量提高15%～30%，大面積推廣雜交小麥對(duì)確保國(guó)家糧食安全有著重要的意義[1-2]。雜交小麥種子生產(chǎn)過程中提高不育系結(jié)實(shí)粒數(shù)是提高制種產(chǎn)量的主要途徑之一[3-4]。多年來，相關(guān)單位積極開展了雜交小麥的高產(chǎn)制種技術(shù)研究，針對(duì)不同的親本組合開展花期調(diào)節(jié)、授粉技術(shù)、隔離技術(shù)、父母本行比、機(jī)械化混播制種等[1，5-8]，但仍然存在制種成本較高、受環(huán)境影響較大且種子質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，不利于雜交小麥的推廣和機(jī)械化制種。因此，建立以高產(chǎn)、低成本為目標(biāo)的規(guī)模化、機(jī)械化、標(biāo)準(zhǔn)化的雜交小麥種子生產(chǎn)技術(shù)體系非常迫切。

如果能夠?qū)⑿←溁ǚ圻M(jìn)行集中收集、保存并保持其花粉活力，將會(huì)推進(jìn)雜交小麥的應(yīng)用進(jìn)程。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外已對(duì)包括主要農(nóng)作物在內(nèi)的170 多種植物開展了花粉超低溫保存技術(shù)研究，并將超低溫保存的花粉成功用于雜交育種研究[9-11]。研究過程中發(fā)現(xiàn)花粉種間特異性很強(qiáng)，不同作物需要不同技術(shù)方案，沒有一種技術(shù)方案可以適宜所有花粉的保存[12]。小麥屬于禾本科作物，其離體花粉活力幾個(gè)小時(shí)內(nèi)迅速降低，壽命很短，不利于花粉活力研究和育種工作的開展，目前僅有關(guān)于八倍體小黑麥花粉的保存研究[12]，關(guān)于普通小麥花粉保存技術(shù)的研究未見成功報(bào)道。如果采用低溫或超低溫冷凍技術(shù)延長(zhǎng)小麥花粉壽命，為加速小麥雜交育種進(jìn)程和種質(zhì)資源的保存提供更好的途徑，將會(huì)有很大的應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)小麥花粉進(jìn)行采集，初步開展了小麥花粉的干燥條件、花粉低溫和超低溫保存條件以及小麥花粉保存后的復(fù)蘇及雜交授粉研究等，旨在確立適合的小麥花粉保存方法，為雜交小麥育種，尤其是跨時(shí)間、跨地區(qū)的雜交育種提供方便，同時(shí)為禾本科作物花粉的長(zhǎng)期保存提供理論依據(jù)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試小麥材料為鎮(zhèn)麥168 和寧麥13。分別于2020 年和2021 年11 月上旬種植于荃銀高科種業(yè)股份有限公司合肥南崗試驗(yàn)田和滁州市定遠(yuǎn)縣東昌試驗(yàn)田，其中鎮(zhèn)麥168 集中種植于南崗試驗(yàn)田用于花粉采集，寧麥13 同時(shí)種植于兩地（南崗試驗(yàn)田和東昌試驗(yàn)田），采用常規(guī)田間管理。

1.2 花粉收集和干燥2021 年和2022 年4 月上旬鎮(zhèn)麥168 小麥?zhǔn)⒒ㄆ?，選擇晴朗天氣，于10：00-12：00 和16：00-18：00 利用自制花粉采集裝置[13]采集花粉至培養(yǎng)皿中，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行干燥處理（溫度20℃、濕度25%）。設(shè)置5 種干燥處理時(shí)間：0h、1h、1.5h、3h、5h。

1.3 花粉保存和復(fù)蘇取不同干燥時(shí)間的花粉，將對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿進(jìn)行密封并裝入鋁箔復(fù)合袋中，設(shè)3 種溫度條件：4℃（4℃冰箱低溫冷藏保存）、-20℃（-20℃冰箱低溫冷凍保存）和-196℃（液氮超低溫冷凍保存）。間隔不同時(shí)段（2d、4d、7d 和368d）后取出花粉進(jìn)行花粉復(fù)蘇。復(fù)蘇方式分別為自來水沖洗復(fù)蘇、室溫自然復(fù)蘇（25℃）和35℃水浴復(fù)蘇，待保存花粉復(fù)蘇至室溫后進(jìn)行雜交授粉試驗(yàn)。

1.4 雜交授粉提前對(duì)兩地種植的寧麥13 進(jìn)行剪穗去雄并套袋，將不同處理的復(fù)蘇后花粉授粉于袋中的寧麥13 穗子，授粉后繼續(xù)套袋隔離，每個(gè)處理設(shè)置20 次重復(fù)。

1.5 調(diào)查指標(biāo)及數(shù)據(jù)分析授粉后，待成熟期調(diào)查統(tǒng)計(jì)小麥每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)；所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥時(shí)間對(duì)小麥花粉授粉效果的影響為了確定合適的花粉干燥時(shí)間，將花粉經(jīng)過不同時(shí)長(zhǎng)的干燥后，分別置于4℃、-20℃和-196℃保存2d，采用室溫（25℃）自然復(fù)蘇花粉并進(jìn)行雜交授粉，用新鮮花粉（干燥0h 未保存）作為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)授粉后每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)。結(jié)果如圖1 所示，在溫度20℃、濕度25%下干燥0h、1h、1.5h、3h 和5h 的花粉授粉均有結(jié)實(shí)，其中干燥0h、1h 和1.5h 每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)差異不大，分別為28 粒、27 粒和24 粒，干燥3h 之后已嚴(yán)重影響授粉結(jié)實(shí)，干燥5h每穗結(jié)實(shí)數(shù)僅為1粒；4℃保存花粉除了干燥0h、1h 有結(jié)實(shí)外，其余處理均無(wú)結(jié)實(shí)；-20℃和-196℃保存的花粉干燥0h 和1h 每穗結(jié)實(shí)數(shù)均超過20 粒，干燥1.5h 之后隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)，每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)逐漸降低，干燥5h 保存2d 后授粉不結(jié)實(shí)。

圖1 不同干燥時(shí)間和保存條件對(duì)小麥?zhǔn)诜劢Y(jié)實(shí)的影響

可見，花粉干燥時(shí)間對(duì)不同保存條件下小麥花粉授粉效果的影響較大。干燥3h 之后的花粉可能由于含水量過低導(dǎo)致花粉活力降低影響保存后授粉結(jié)實(shí)，干燥0h、1h、1.5h 均可進(jìn)行-20℃和-196℃保存，其中干燥1h 對(duì)花粉活力影響最小，保存授粉結(jié)實(shí)效果最好。4℃保存條件下除了0h、1h，其余干燥時(shí)間均不結(jié)實(shí)，達(dá)不到育種需求。因此干燥1h是低溫冷凍和超低溫冷凍保存花粉高活力的最優(yōu)干燥時(shí)間。

2.2 不同解凍復(fù)蘇處理方式對(duì)每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)的影響取干燥1h 的4℃（低溫冷藏）、-20℃（低溫冷凍）和-196℃（超低溫冷凍）保存2d 的花粉，分別用自來水沖洗復(fù)蘇、室溫（25℃）自然復(fù)蘇和35℃水浴復(fù)蘇3 種方法進(jìn)行花粉復(fù)蘇處理，并授粉于去雄的寧麥13 進(jìn)行雜交試驗(yàn)。結(jié)果如圖2 所示，-20℃保存后采用室溫（25℃）自然復(fù)蘇平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)最高，其次是35℃水浴復(fù)蘇，而采用自來水沖洗復(fù)蘇花粉授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)最低。-196℃保存后采用35℃水浴復(fù)蘇平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)最高，其次是室溫（25℃）自然復(fù)蘇，采用自來水沖洗復(fù)蘇花粉授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)最低。4℃保存后花粉不同復(fù)蘇方式的結(jié)實(shí)粒數(shù)均較低。其中-20℃保存的花粉室溫（25℃）自然復(fù)蘇與35℃水浴復(fù)蘇授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)僅相差2 粒，-196℃保存的花粉室溫（25℃）自然復(fù)蘇與35℃水浴復(fù)蘇授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)僅相差1 粒，但這兩種復(fù)蘇方法的授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)均高于自來水沖洗復(fù)蘇?？梢姡捎檬覝兀?5℃）自然復(fù)蘇是簡(jiǎn)便適合的小麥花粉復(fù)蘇方式。

圖2 不同復(fù)蘇方式對(duì)小麥?zhǔn)诜劢Y(jié)實(shí)的影響

2.3 不同保存時(shí)間對(duì)每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)的影響將收集的鎮(zhèn)麥168 花粉在溫度20℃、濕度25%、干燥1h后，分別于4℃、-20℃以及-196℃保存2d、4d、7d 和368d，取出進(jìn)行室溫（25℃）自然復(fù)蘇并授粉去雄的寧麥13。結(jié)果如圖3 所示，4℃保存2d 的花粉授粉后平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)僅2 粒，保存至4d 之后均不結(jié)實(shí)；-20℃保存7d 之內(nèi)授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)變幅在21～23 粒之間，但保存1 年（368d）之后的花粉授粉結(jié)實(shí)粒數(shù)明顯降低；而-196℃保存2d 至368d 的花粉授粉后平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)變幅在22～25粒之間，無(wú)明顯變化?？梢?，4℃除了保存2d 有結(jié)實(shí)外，其余均不結(jié)實(shí)，達(dá)不到育種需求；-20℃（低溫冷凍）環(huán)境可短期（7d）保存小麥花粉；而-196℃（超低溫冷凍）則適宜花粉的長(zhǎng)期（368d）保存。

圖3 不同保存時(shí)間對(duì)小麥?zhǔn)诜劢Y(jié)實(shí)的影響

2.4 保存花粉異地授粉及雜交種真實(shí)性驗(yàn)證為了驗(yàn)證-20℃（低溫冷凍）和-196℃（超低溫冷凍）的花粉在其他地區(qū)授粉結(jié)實(shí)的可行性，將-20℃和-196℃保存7d 的花粉放入存有干冰的低溫保溫箱中，從合肥運(yùn)至滁州市定遠(yuǎn)縣東昌試驗(yàn)田，進(jìn)行花粉室溫（25℃）復(fù)蘇后授粉于去雄的寧麥13，結(jié)果如表1 所示，定遠(yuǎn)與合肥平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)基本無(wú)差異，且與新鮮花粉授粉平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)相差不大，僅相差1～4 粒，得出小麥花粉經(jīng)過-20℃和-196℃保存后可進(jìn)行異地授粉。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，避免由于去雄不干凈自交導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差，進(jìn)一步對(duì)兩地收獲的雜交F1種子進(jìn)行真實(shí)性驗(yàn)證，利用NY/T 2470—2013《小麥品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR分子標(biāo)記法》進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明雜交F1種子真實(shí)性均達(dá)到96.0%以上，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 花粉保存后異地授粉結(jié)實(shí)及雜交種真實(shí)性

3 討論與結(jié)論

雜交小麥被認(rèn)為是緩解極端天氣、提高小麥綜合生產(chǎn)能力的重要途徑[14-15]，已陸續(xù)審定了一批雜交小麥品種，并在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，如2008 年綿雜麥168 以8565kg/hm2的產(chǎn)量刷新了四川盆地小麥單產(chǎn)新紀(jì)錄[14]。但是雜交小麥在應(yīng)用中仍然存在著一些有待解決的科學(xué)和產(chǎn)業(yè)問題，其中規(guī)?；咝е品N技術(shù)就是雜交小麥大面積推廣的重點(diǎn)和難點(diǎn)。為此，團(tuán)隊(duì)提出將小麥花粉進(jìn)行集中收集并在特殊的條件下保存，進(jìn)而延長(zhǎng)花粉壽命，可拓寬小麥配組育種的雙親生育期的差距，并拓寬雜交小麥的遺傳距離，為小麥育種的授粉雜交提供了方便，利于加速育種進(jìn)程。同時(shí)，對(duì)于小麥產(chǎn)業(yè)特別是降低制種成本，克服雜交制種花期不育或花時(shí)不同步，提高土地利用率，提高機(jī)械化水平，完善種質(zhì)資源的保存以及提升雜交小麥的雜種優(yōu)勢(shì)利用等都具有非常重要的價(jià)值。

花粉干燥處理是低溫冷凍和超低溫保存花粉高活力的關(guān)鍵因素，不干燥或含水量過高花粉在結(jié)凍和化凍的過程中容易產(chǎn)生冰晶使細(xì)胞膜受損，而干燥時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致花粉活力降低，導(dǎo)致低溫保存后的活力更低[12]。在農(nóng)作物花粉的研究中，胡晉等[16]研究水稻花粉在10℃干燥3h 較適宜水稻恢復(fù)系花粉的超低溫保存。孫果忠[17]研究得出花粉含水量在11.3%～14.7%范圍是玉米花粉超低溫保存成功的關(guān)鍵。本研究通過采集小麥花粉，采用在溫度20℃、濕度25%條件下進(jìn)行干燥處理，得出干燥1h 再低溫冷凍保存和超低溫保存授粉后平均每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)與對(duì)照基本相同。

花粉超低溫保存后復(fù)蘇化凍處理也是決定花粉活力高低的關(guān)鍵因素，較好的復(fù)蘇方式既能避免化凍過程中水的滲透沖擊對(duì)細(xì)胞膜體系的破壞，又能防止花粉細(xì)胞內(nèi)的再次結(jié)冰[12]。王彩紅等[18]采用不同溫度復(fù)蘇杏花粉，得出含水量越高的材料復(fù)蘇溫度越高。本研究初步得出-196℃保存的小麥花粉適宜35℃水浴復(fù)蘇，-20℃保存的花粉則更適宜室溫（25℃）自然復(fù)蘇。

本研究采用儲(chǔ)存后花粉直接進(jìn)行雜交授粉的方法，雖然不能非常精確反映出花粉生活力[19]，但這是最能指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)的方法，也是最有效的檢測(cè)方法。本試驗(yàn)中不同保存條件對(duì)花粉的授粉結(jié)實(shí)影響不同，4℃低溫冷藏環(huán)境不利于小麥花粉保存，-20℃低溫冷凍保存隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)至7d，花粉授粉結(jié)實(shí)粒數(shù)較對(duì)照無(wú)明顯變化，花粉活力基本不變，而保存時(shí)間延長(zhǎng)至1 年（368d）花粉活力明顯降低，得出-20℃有利于花粉的短期（7d）保存。由于7d 和368d 間隔時(shí)間過大，-20℃是否適合7d 以上的保存時(shí)間還有待進(jìn)一步的研究。-196℃液氮保存1 年（368d）對(duì)花粉的授粉效果影響不大，說明-196℃適宜花粉的長(zhǎng)期保存。在生產(chǎn)中可以根據(jù)不同目的選擇經(jīng)濟(jì)合適的保存方法。本研究對(duì)小麥花粉進(jìn)行低溫和超低溫保存比較試驗(yàn)，為雜交小麥制種提供了重要的技術(shù)支撐。

團(tuán)隊(duì)初步研究了小麥花粉低溫冷藏、低溫冷凍保存和超低溫冷凍保存技術(shù)，首先對(duì)小麥花粉進(jìn)行短期和長(zhǎng)期保存，研究保存后的花粉對(duì)雜交授粉結(jié)實(shí)影響，發(fā)現(xiàn)小麥花粉低溫冷凍保存和超低溫冷凍保存具有可行性。初步結(jié)論如下：（1）小麥花粉不干燥（干燥0h）可以直接進(jìn)行低溫冷凍和超低溫保存；在溫度20℃、濕度25%條件下，干燥1h 是低溫冷凍和超低溫保存后花粉高活力的最優(yōu)干燥時(shí)間。（2）4℃不利于小麥花粉的保存，-20℃（低溫冷凍）可短期（7d）保存小麥花粉，-196℃（超低溫冷凍）適宜花粉的長(zhǎng)期（368d）保存。（3）-20℃（低溫冷凍）保存小麥花粉的最佳復(fù)蘇方式是室溫（25℃）自然復(fù)蘇；-196℃（超低溫冷凍）保存小麥花粉的最佳復(fù)蘇方式是35℃水浴復(fù)蘇，綜合采用室溫（25℃）自然復(fù)蘇是簡(jiǎn)便適合的小麥花粉復(fù)蘇方式。（4）小麥花粉低溫冷凍和超低溫冷凍保存后，可異地授粉。