宮英闌，溫 冉，史孝偉，袁煥青，張 妍，包佳鷺，王曉丹*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北象大合眾生物科技有限公司，河北 正定 050800)

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)分子式為C8HO2F15,又稱十五氟辛酸。由于其具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、疏水和疏油的特性，被廣泛應(yīng)用于生活中常見的物質(zhì)中，如服裝、化妝品、廚具、裝修材料等[1]。PFOA的大量使用使環(huán)境介質(zhì)、土壤，甚至在偏遠的極地都能檢測到它的存在[2]。使動物通過身邊的大氣顆粒、水源、土壤等途徑接觸到PFOA，長時間在體內(nèi)蓄積產(chǎn)生生物毒性。前期研究表明，妊娠期PFOA暴露會引起流產(chǎn)和胎兒發(fā)育緩慢、孕鼠體質(zhì)量下降、仔鼠存活率降低、子代雄鼠睪丸組織受損、精子數(shù)量減少、血清睪酮水平降低等[3-4]。

枸杞是傳統(tǒng)的滋補中藥，具有護肝明目，益精補腎等功效。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharids,LBP)是從中藥枸杞中提取出，是枸杞的主要活性成分?，F(xiàn)代研究表明LBP具有抗氧化、抗腫瘤，降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫力以及對生殖系統(tǒng)具有保護作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，LBP對大鼠卵巢系統(tǒng)有明顯的保護作用，可恢復(fù)老年大鼠血清雌激素和孕酮水平[6]。LIU等[7]通過建立卵巢損傷模型，同時給小鼠灌胃LBP發(fā)現(xiàn)顯著提高了小鼠卵巢中原始卵泡和初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡的比例，降低了閉鎖卵泡的比例。

本試驗建立妊娠期暴露PFOA致子代雌鼠卵巢損傷模型，并使用不同濃度的LBP進行緩解。通過對青春期子代雌鼠血清中激素水平以及卵巢組織激素受體表達、氧化指標以及對卵母細胞減數(shù)分裂相關(guān)基因檢測，探討LBP對生殖功能的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑PFOA(純度≥98%，Sigma公司)；LBP(上海源葉生物科技公司)；40%甲醛、黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體(ERβ)、活性氧(ROS)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、蛋白定量(TP)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)；引物由大連寶生生物設(shè)計并合成，具體序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2 實驗動物飼養(yǎng)與給藥8周齡雌性SPF級昆明小鼠60只和8周齡雄性SPF級昆明小鼠30只由北京斯貝福生物科技有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2019-0010。動物自由采食和飲水飼養(yǎng)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物房，保持室溫(23±1)℃，12 h光照，12 h黑暗。適應(yīng)1周后，傍晚雌鼠與雄鼠2∶1合籠，次日早晨檢查雌鼠陰栓，有陰栓的定為孕0 d。將60只懷孕的小鼠隨機分為6組，分別為空白對照組(K組)、PFOA組(P組)、LBP對照組(L組)、低劑量治療組(D組)、中劑量治療組(Z組)、高劑量治療組(G組)，每組10只。妊娠1～17 d 口服灌胃給藥，每只鼠0.2 mL，每天稱小鼠體質(zhì)量按照體質(zhì)量給藥，具體給藥方式如表2。哺乳期不給藥，子代小鼠21日齡時斷奶，將子代雌鼠與雄鼠分開，正常飼喂到35 d，眼球采血，頸椎脫臼處死，無菌收集卵巢。

表2 LBP對子代雌鼠PFOA毒性緩解作用的給藥方式

1.3 子代雌鼠體質(zhì)量及卵巢指數(shù)記錄各組雌鼠出生35 d時的體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量，計算分析雌鼠35 d 時的卵巢指數(shù)，卵巢指數(shù)(%)=卵巢質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.4 血清中LH、FSH、E2、GnRH含量測定小鼠眼球采血，室溫凝固10～20 min，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清,嚴格按照說明書進行操作，檢測血清中LH、FSH、E2、GnRH的含量。

1.5 卵巢組織中ERα、ERβ水平卵巢與PBS(PH 7.2～7.4)的比例為1∶9，勻漿器勻漿，3 000 r/min離心20 min，仔細收集上清，按照檢測試劑盒說明書操作，檢測組織中ERα、ERβ水平。

1.6 組織SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS水平的測定按照小鼠卵巢與生理鹽水的比例為1∶9，制作10%的卵巢組織勻漿，用蛋白定量測試盒檢測并計算勻漿蛋白濃度。嚴格按照說明書操作，檢測各組卵巢組織中SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS的水平。

1.7 熒光定量PCR對卵母細胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因表達的檢測稱取20 mg卵巢組織，加入500 μL 的裂解液，按照總RNA提取試劑盒說明書操作提取卵巢組織中的總RNA提取。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA待測。具體反轉(zhuǎn)錄體系如表3。以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因使用LightCycler?96全自動熒光定量PCR儀，采用2-step PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。按照公式2-△△Ct值計算各基因的相對表達量。

表3 反轉(zhuǎn)錄體系及方法 μL

2 結(jié)果

2.1 LBP對子代雌鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及卵巢指數(shù)的影響如表4所示，與空白對照組相比，PFOA組子代雌鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，卵巢質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，卵巢指數(shù)極顯著升高(P<0.01)。與PFOA組相比，高劑量治療組子代雌鼠體質(zhì)量極顯著升高(P<0.01)，中劑量治療組子代雌鼠卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。高劑量治療組卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)雖然無統(tǒng)計學(xué)差異，但與PFOA組相比有降低的趨勢。另外，LBP對照組與空白組各指標無顯著性差異。

表4 LBP對子代雌鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及卵巢指數(shù)的影響

2.2 LBP對子代雌鼠血清中LH、FSH、E2、GnRH含量的影響如圖1所示，與空白對照組相比，3.5 mg/kg PFOA可以極顯著降低子代雌鼠血清中LH、FSH、GnRH的含量(P<0.01)，極顯著升高E2含量(P<0.01)。與PFOA組相比，中劑量治療組和高劑量治療組可以極顯著升高LH的含量(P<0.01)，高劑量組可以極顯著升高FSH的含量(P<0.01)，其中高劑量的LBP對于恢復(fù)LH水平效果更好。另外低劑量治療組、中劑量組極顯著升高GnRH的含量(P<0.01)，極顯著降低E2含量(P<0.01)，使GnRH與E2的含量與空白組無顯著性差異。

圖1 LBP對子代雌鼠血清中FSH(A)、LH(B)、E2(C)、GnRH(D)含量的影響

2.3 LBP對子代雌鼠卵巢組織中ERα、ERβ水平的影響如圖2所示，與空白組相比，PFOA組極顯著升高了子代雌鼠卵巢組織中ERα、ERβ水平(P<0.01)，高劑量治療組極顯著降低了ERα、ERβ水平(P<0.01)。LBP對照組與空白對照組無明顯差異。

圖2 LBP對子代雌鼠卵巢組織中ERα(A)、ERβ(B)水平的影響

2.4 LBP對子代雌鼠卵巢組織SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS水平的影響如圖3所示，與空白組相比，3.5 mg/kg PFOA可以極顯著降低卵巢組織中SOD、CAT、T-AOC水平(P<0.01)，極顯著升高MDA、ROS水平(P<0.01)。與PFOA組相比，低劑量治療組與中劑量治療組可以顯著升高卵巢組織中SOD活力(P<0.05)，高劑量治療組可以極顯著升高卵巢組織中SOD活力(P<0.01)。低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組均極顯著升高了卵巢組織中CAT含量，降低MDA的含量(P<0.01)。中劑量治療組和高劑量治療組極顯著升高卵巢組織的總抗氧化能力(P<0.01)。中劑量治療組可以顯著降低卵巢組織中ROS含量(P<0.05)，高劑量治療組可以極顯著降低卵巢組織中ROS的含量(P<0.01)。對于多糖對照組來說，均與空白組無顯著性差異。

圖3 LBP對子代雌鼠卵巢組織CAT(A)、SOD(B)、T-AOC(C)、MDA(D)、ROS(E)水平的影響

2.5 LBP對子代雌鼠卵巢組織中卵母細胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因的影響從圖4可以看出，與空白對照組相比，3.5 mg/kg的PFOA可以極顯著降低卵巢組織中卵母細胞減數(shù)分裂關(guān)鍵基因smc1α、smc1β、smc3、rec8 mRNA的表達(P<0.01)，低劑量治療組可以顯著升高smc3 mRNA的表達(P<0.05)，中劑量和高劑量治療組可以極顯著升高smc1α、smc1β、smc3、rec8 mRNA的表達(P<0.01)。

圖4 LBP對子代雌鼠卵巢組織smc1α(A)、smc1β(B)、smc3(C)、rec8(D)mRNA表達的影響

3 討論

妊娠期是胚胎和胎兒在母體內(nèi)發(fā)育成熟時期，而妊娠期卵子發(fā)生的卵母細胞第1次減數(shù)分裂以及原始卵泡的形成對雌性動物以后的生殖能力起著決定性作用[8]，因此本試驗選擇在妊娠期給藥，探討3.5 mg/kg PFOA對子代35日齡雌性小鼠生殖功能的損傷以及不同劑量LBP對生殖系統(tǒng)的保護作用。

結(jié)果顯示，妊娠期暴露3.5 mg/kg PFOA使出生后35 d的子代雌鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，卵巢質(zhì)量顯著升高(P<0.05),因此卵巢指數(shù)偏低(P<0.01)。這與VAN等[9]推斷PFOA使子代雌鼠體質(zhì)量降低，子代雄鼠體質(zhì)量升高一致。而120 mg/kg LBP使小鼠的體質(zhì)量恢復(fù)至與空白組無顯著性差異。40，80，120 mg/kg LBP均可對小鼠卵巢質(zhì)量的恢復(fù)起作用，而80 mg/kg可顯著緩解PFOA致子代雌鼠卵巢質(zhì)量降低的現(xiàn)象(P<0.05)。

卵巢的內(nèi)分泌功能受到下丘腦-腺垂體-卵巢軸的調(diào)控。下丘腦分泌GnRH經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)直接作用于腺垂體，促進腺垂體分泌FSH和LH[10]。FSH可刺激卵泡細胞增殖和促進卵泡的生長發(fā)育，LH可促進排卵和黃體生成。二者共同作用于卵巢，使卵巢分泌E2和孕酮。本試驗結(jié)果顯示，PFOA可使小鼠血清中GnRH、LH、FSH的含量極顯著降低(P<0.01)，E2含量極顯著升高(P<0.01)?？赡芘cPFOA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有擬雌激素特性[11]，可以與雌激素受體競爭性結(jié)合從而使體內(nèi)游離的雌激素增加。大量的雌激素負反饋作用于下丘腦-垂體，抑制其分泌GnRH，抑制腺垂體分泌FSH和LH，從而影響卵泡的正常發(fā)育和成熟。40和80 mg/kg LBP均可使小鼠血清中E2、GnRH恢復(fù)至與空白組無顯著性差異，80和120 mg/kg LBP可以升高小鼠血清中LH含量，120 mg/kg LBP可以升高小鼠血清中FSH水平。這表明LBP對妊娠期暴露PFOA所致子代雌鼠生殖內(nèi)分泌失調(diào)具有緩解作用。

經(jīng)典的雌激素受體位于細胞核，包括ERα和ERβ2種亞型，其蛋白質(zhì)在翻譯后會暫時性的在包漿出現(xiàn)，因此可在細胞質(zhì)檢測到[12]。ERα和ERβ與雌激素的親和力存在差異，一般情況下ERα與雌激素的親和力較強，只有雌激素水平過高時，ERβ才被激活[13]。PFOA可能作為雌激素化合物激活雌激素受體使子代雌鼠卵巢組織中ERα和ERβ的表達增多。有文獻報道，通過體內(nèi)試驗證明PFOA對雌性大鼠體內(nèi)的ERα表達有促進作用[11]，與本試驗結(jié)果一致。而120 mg/kg LBP可以使卵巢中激素受體的表達恢復(fù)正常水平。

目前有很多研究表明PFOA可以通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致雄性動物生殖損傷，但很少有人研究PFOA是否誘導(dǎo)卵巢氧化應(yīng)激。而LBP是天然的抗氧化劑，可以緩解PFOA致小鼠肝臟[14]、睪丸[15]發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷。當機體受到氧化應(yīng)激原的刺激后會產(chǎn)生大量的自由基，過量自由基通過攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化物作用，從而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，如MDA。MDA含量的多少可以直接反映出細胞遭受氧化損傷的程度。而SOD、CAT可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基[16]。因此本研究檢測了卵巢組織勻漿中的ROS、MDA、SOD、CAT以及總抗氧化能力T-AOC水平。發(fā)現(xiàn)母鼠妊娠期暴露3.5 mg/kg的PFOA后子代小鼠卵巢中SOD、CAT、T-AOC水平顯著降低，同時MDA、ROS水平顯著升高。LBP用治療后發(fā)現(xiàn)這些指標發(fā)生不同程度改善，且80，120 mg/kg的治療效果較好。

妊娠期暴露雌激素以及具有擬雌激素特性的環(huán)境污染物可以通過激活雌激素受體從而影響同源重組,并下調(diào)一系列減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的表達[17-18]。rec8是卵母細胞減數(shù)分裂特異性基因，它可以影響卵母細胞的增殖、凋亡，正常情況下小鼠體內(nèi)rec8在睪丸和卵巢中表達量高，而在其他組織中不表達或者表達量很低[19]。smc1、smc3是減數(shù)分裂內(nèi)聚蛋白復(fù)合物的核心亞基，是染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白，smc1又包括smc1α和smc1β。缺乏smc1β的小鼠不能完成減數(shù)分裂，雌鼠與雄鼠均表現(xiàn)為不育，說明smc1β是減數(shù)分裂所必須的[20]。中藥制劑和顏坤泰膠囊具有緩解女性卵巢功能的功效，能增加老齡小鼠卵母細胞的卵泡數(shù)量，抑制卵母細胞凋亡，并有提高減數(shù)分裂特異性內(nèi)聚亞基rec8和smc1β的趨勢[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，將分離得到的14.5 d小鼠胚胎卵巢置于含DBP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)胎鼠卵巢中的rec8、smc1β、smc3的mRNA表達水平顯著降低[22]。因此檢測PFOA是否可以影響減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFOA顯著下調(diào)卵巢組織中rec8、smc1α、smc1β、smc3 mRNA的表達。80，120 mg/kg的LBP可以提高rec8、smc1α、smc1β、smc3 mRNA 水平，說明其對PFOA造成的生殖損傷有緩解作用。

PFOA可以通過減少SOD、CAT、T-AOC的水平，增加ROS、MDA含量導(dǎo)致子代雌鼠卵巢組織的損傷。還可以降低血清中的FSH、LH、GnRH含量，升高E2水平，提高卵巢組織中ERα、ERβ含量，下調(diào)卵巢組織中卵母細胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因的表達，而LBP可以緩解PFOA造成的子代雌鼠卵巢損傷。