宮英闌，溫 冉，史孝偉，袁煥青，張 妍，包佳鷺，王曉丹*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北象大合眾生物科技有限公司，河北 正定 050800)

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)分子式為C8HO2F15,又稱十五氟辛酸。由于其具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、疏水和疏油的特性，被廣泛應(yīng)用于生活中常見的物質(zhì)中，如服裝、化妝品、廚具、裝修材料等[1]。PFOA的大量使用使環(huán)境介質(zhì)、土壤，甚至在偏遠(yuǎn)的極地都能檢測(cè)到它的存在[2]。使動(dòng)物通過身邊的大氣顆粒、水源、土壤等途徑接觸到PFOA，長(zhǎng)時(shí)間在體內(nèi)蓄積產(chǎn)生生物毒性。前期研究表明，妊娠期PFOA暴露會(huì)引起流產(chǎn)和胎兒發(fā)育緩慢、孕鼠體質(zhì)量下降、仔鼠存活率降低、子代雄鼠睪丸組織受損、精子數(shù)量減少、血清睪酮水平降低等[3-4]。

枸杞是傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥，具有護(hù)肝明目，益精補(bǔ)腎等功效。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharids,LBP)是從中藥枸杞中提取出，是枸杞的主要活性成分?，F(xiàn)代研究表明LBP具有抗氧化、抗腫瘤，降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫力以及對(duì)生殖系統(tǒng)具有保護(hù)作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，LBP對(duì)大鼠卵巢系統(tǒng)有明顯的保護(hù)作用，可恢復(fù)老年大鼠血清雌激素和孕酮水平[6]。LIU等[7]通過建立卵巢損傷模型，同時(shí)給小鼠灌胃LBP發(fā)現(xiàn)顯著提高了小鼠卵巢中原始卵泡和初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡的比例，降低了閉鎖卵泡的比例。

本試驗(yàn)建立妊娠期暴露PFOA致子代雌鼠卵巢損傷模型，并使用不同濃度的LBP進(jìn)行緩解。通過對(duì)青春期子代雌鼠血清中激素水平以及卵巢組織激素受體表達(dá)、氧化指標(biāo)以及對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)基因檢測(cè)，探討LBP對(duì)生殖功能的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑PFOA(純度≥98%，Sigma公司)；LBP(上海源葉生物科技公司)；40%甲醛、黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體(ERβ)、活性氧(ROS)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、蛋白定量(TP)、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)；引物由大連寶生生物設(shè)計(jì)并合成，具體序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與給藥8周齡雌性SPF級(jí)昆明小鼠60只和8周齡雄性SPF級(jí)昆明小鼠30只由北京斯貝福生物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物自由采食和飲水飼養(yǎng)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，保持室溫(23±1)℃，12 h光照，12 h黑暗。適應(yīng)1周后，傍晚雌鼠與雄鼠2∶1合籠，次日早晨檢查雌鼠陰栓，有陰栓的定為孕0 d。將60只懷孕的小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組(K組)、PFOA組(P組)、LBP對(duì)照組(L組)、低劑量治療組(D組)、中劑量治療組(Z組)、高劑量治療組(G組)，每組10只。妊娠1～17 d 口服灌胃給藥，每只鼠0.2 mL，每天稱小鼠體質(zhì)量按照體質(zhì)量給藥，具體給藥方式如表2。哺乳期不給藥，子代小鼠21日齡時(shí)斷奶，將子代雌鼠與雄鼠分開，正常飼喂到35 d，眼球采血，頸椎脫臼處死，無菌收集卵巢。

表2 LBP對(duì)子代雌鼠PFOA毒性緩解作用的給藥方式

1.3 子代雌鼠體質(zhì)量及卵巢指數(shù)記錄各組雌鼠出生35 d時(shí)的體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量，計(jì)算分析雌鼠35 d 時(shí)的卵巢指數(shù)，卵巢指數(shù)(%)=卵巢質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.4 血清中LH、FSH、E2、GnRH含量測(cè)定小鼠眼球采血，室溫凝固10～20 min，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中LH、FSH、E2、GnRH的含量。

1.5 卵巢組織中ERα、ERβ水平卵巢與PBS(PH 7.2～7.4)的比例為1∶9，勻漿器勻漿，3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清，按照檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)組織中ERα、ERβ水平。

1.6 組織SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS水平的測(cè)定按照小鼠卵巢與生理鹽水的比例為1∶9，制作10%的卵巢組織勻漿，用蛋白定量測(cè)試盒檢測(cè)并計(jì)算勻漿蛋白濃度。嚴(yán)格按照說明書操作，檢測(cè)各組卵巢組織中SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS的水平。

1.7 熒光定量PCR對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因表達(dá)的檢測(cè)稱取20 mg卵巢組織，加入500 μL 的裂解液，按照總RNA提取試劑盒說明書操作提取卵巢組織中的總RNA提取。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA待測(cè)。具體反轉(zhuǎn)錄體系如表3。以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因使用LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR儀，采用2-step PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。按照公式2-△△Ct值計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表3 反轉(zhuǎn)錄體系及方法 μL

2 結(jié)果

2.1 LBP對(duì)子代雌鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及卵巢指數(shù)的影響如表4所示，與空白對(duì)照組相比，PFOA組子代雌鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，卵巢質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，卵巢指數(shù)極顯著升高(P<0.01)。與PFOA組相比，高劑量治療組子代雌鼠體質(zhì)量極顯著升高(P<0.01)，中劑量治療組子代雌鼠卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。高劑量治療組卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與PFOA組相比有降低的趨勢(shì)。另外，LBP對(duì)照組與空白組各指標(biāo)無顯著性差異。

表4 LBP對(duì)子代雌鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及卵巢指數(shù)的影響

2.2 LBP對(duì)子代雌鼠血清中LH、FSH、E2、GnRH含量的影響如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，3.5 mg/kg PFOA可以極顯著降低子代雌鼠血清中LH、FSH、GnRH的含量(P<0.01)，極顯著升高E2含量(P<0.01)。與PFOA組相比，中劑量治療組和高劑量治療組可以極顯著升高LH的含量(P<0.01)，高劑量組可以極顯著升高FSH的含量(P<0.01)，其中高劑量的LBP對(duì)于恢復(fù)LH水平效果更好。另外低劑量治療組、中劑量組極顯著升高GnRH的含量(P<0.01)，極顯著降低E2含量(P<0.01)，使GnRH與E2的含量與空白組無顯著性差異。

圖1 LBP對(duì)子代雌鼠血清中FSH(A)、LH(B)、E2(C)、GnRH(D)含量的影響

2.3 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織中ERα、ERβ水平的影響如圖2所示，與空白組相比，PFOA組極顯著升高了子代雌鼠卵巢組織中ERα、ERβ水平(P<0.01)，高劑量治療組極顯著降低了ERα、ERβ水平(P<0.01)。LBP對(duì)照組與空白對(duì)照組無明顯差異。

圖2 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織中ERα(A)、ERβ(B)水平的影響

2.4 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織SOD、MDA、CAT、T-AOC、ROS水平的影響如圖3所示，與空白組相比，3.5 mg/kg PFOA可以極顯著降低卵巢組織中SOD、CAT、T-AOC水平(P<0.01)，極顯著升高M(jìn)DA、ROS水平(P<0.01)。與PFOA組相比，低劑量治療組與中劑量治療組可以顯著升高卵巢組織中SOD活力(P<0.05)，高劑量治療組可以極顯著升高卵巢組織中SOD活力(P<0.01)。低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組均極顯著升高了卵巢組織中CAT含量，降低MDA的含量(P<0.01)。中劑量治療組和高劑量治療組極顯著升高卵巢組織的總抗氧化能力(P<0.01)。中劑量治療組可以顯著降低卵巢組織中ROS含量(P<0.05)，高劑量治療組可以極顯著降低卵巢組織中ROS的含量(P<0.01)。對(duì)于多糖對(duì)照組來說，均與空白組無顯著性差異。

圖3 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織CAT(A)、SOD(B)、T-AOC(C)、MDA(D)、ROS(E)水平的影響

2.5 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因的影響從圖4可以看出，與空白對(duì)照組相比，3.5 mg/kg的PFOA可以極顯著降低卵巢組織中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂關(guān)鍵基因smc1α、smc1β、smc3、rec8 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，低劑量治療組可以顯著升高smc3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，中劑量和高劑量治療組可以極顯著升高smc1α、smc1β、smc3、rec8 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

圖4 LBP對(duì)子代雌鼠卵巢組織smc1α(A)、smc1β(B)、smc3(C)、rec8(D)mRNA表達(dá)的影響

3 討論

妊娠期是胚胎和胎兒在母體內(nèi)發(fā)育成熟時(shí)期，而妊娠期卵子發(fā)生的卵母細(xì)胞第1次減數(shù)分裂以及原始卵泡的形成對(duì)雌性動(dòng)物以后的生殖能力起著決定性作用[8]，因此本試驗(yàn)選擇在妊娠期給藥，探討3.5 mg/kg PFOA對(duì)子代35日齡雌性小鼠生殖功能的損傷以及不同劑量LBP對(duì)生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用。

結(jié)果顯示，妊娠期暴露3.5 mg/kg PFOA使出生后35 d的子代雌鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，卵巢質(zhì)量顯著升高(P<0.05),因此卵巢指數(shù)偏低(P<0.01)。這與VAN等[9]推斷PFOA使子代雌鼠體質(zhì)量降低，子代雄鼠體質(zhì)量升高一致。而120 mg/kg LBP使小鼠的體質(zhì)量恢復(fù)至與空白組無顯著性差異。40，80，120 mg/kg LBP均可對(duì)小鼠卵巢質(zhì)量的恢復(fù)起作用，而80 mg/kg可顯著緩解PFOA致子代雌鼠卵巢質(zhì)量降低的現(xiàn)象(P<0.05)。

卵巢的內(nèi)分泌功能受到下丘腦-腺垂體-卵巢軸的調(diào)控。下丘腦分泌GnRH經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)直接作用于腺垂體，促進(jìn)腺垂體分泌FSH和LH[10]。FSH可刺激卵泡細(xì)胞增殖和促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，LH可促進(jìn)排卵和黃體生成。二者共同作用于卵巢，使卵巢分泌E2和孕酮。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PFOA可使小鼠血清中GnRH、LH、FSH的含量極顯著降低(P<0.01)，E2含量極顯著升高(P<0.01)?？赡芘cPFOA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有擬雌激素特性[11]，可以與雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而使體內(nèi)游離的雌激素增加。大量的雌激素負(fù)反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉X-垂體，抑制其分泌GnRH，抑制腺垂體分泌FSH和LH，從而影響卵泡的正常發(fā)育和成熟。40和80 mg/kg LBP均可使小鼠血清中E2、GnRH恢復(fù)至與空白組無顯著性差異，80和120 mg/kg LBP可以升高小鼠血清中LH含量，120 mg/kg LBP可以升高小鼠血清中FSH水平。這表明LBP對(duì)妊娠期暴露PFOA所致子代雌鼠生殖內(nèi)分泌失調(diào)具有緩解作用。

經(jīng)典的雌激素受體位于細(xì)胞核，包括ERα和ERβ2種亞型，其蛋白質(zhì)在翻譯后會(huì)暫時(shí)性的在包漿出現(xiàn)，因此可在細(xì)胞質(zhì)檢測(cè)到[12]。ERα和ERβ與雌激素的親和力存在差異，一般情況下ERα與雌激素的親和力較強(qiáng)，只有雌激素水平過高時(shí)，ERβ才被激活[13]。PFOA可能作為雌激素化合物激活雌激素受體使子代雌鼠卵巢組織中ERα和ERβ的表達(dá)增多。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過體內(nèi)試驗(yàn)證明PFOA對(duì)雌性大鼠體內(nèi)的ERα表達(dá)有促進(jìn)作用[11]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而120 mg/kg LBP可以使卵巢中激素受體的表達(dá)恢復(fù)正常水平。

目前有很多研究表明PFOA可以通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致雄性動(dòng)物生殖損傷，但很少有人研究PFOA是否誘導(dǎo)卵巢氧化應(yīng)激。而LBP是天然的抗氧化劑，可以緩解PFOA致小鼠肝臟[14]、睪丸[15]發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激原的刺激后會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，過量自由基通過攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化物作用，從而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，如MDA。MDA含量的多少可以直接反映出細(xì)胞遭受氧化損傷的程度。而SOD、CAT可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基[16]。因此本研究檢測(cè)了卵巢組織勻漿中的ROS、MDA、SOD、CAT以及總抗氧化能力T-AOC水平。發(fā)現(xiàn)母鼠妊娠期暴露3.5 mg/kg的PFOA后子代小鼠卵巢中SOD、CAT、T-AOC水平顯著降低，同時(shí)MDA、ROS水平顯著升高。LBP用治療后發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)發(fā)生不同程度改善，且80，120 mg/kg的治療效果較好。

妊娠期暴露雌激素以及具有擬雌激素特性的環(huán)境污染物可以通過激活雌激素受體從而影響同源重組,并下調(diào)一系列減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的表達(dá)[17-18]。rec8是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂特異性基因，它可以影響卵母細(xì)胞的增殖、凋亡，正常情況下小鼠體內(nèi)rec8在睪丸和卵巢中表達(dá)量高，而在其他組織中不表達(dá)或者表達(dá)量很低[19]。smc1、smc3是減數(shù)分裂內(nèi)聚蛋白復(fù)合物的核心亞基，是染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白，smc1又包括smc1α和smc1β。缺乏smc1β的小鼠不能完成減數(shù)分裂，雌鼠與雄鼠均表現(xiàn)為不育，說明smc1β是減數(shù)分裂所必須的[20]。中藥制劑和顏坤泰膠囊具有緩解女性卵巢功能的功效，能增加老齡小鼠卵母細(xì)胞的卵泡數(shù)量，抑制卵母細(xì)胞凋亡，并有提高減數(shù)分裂特異性內(nèi)聚亞基rec8和smc1β的趨勢(shì)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，將分離得到的14.5 d小鼠胚胎卵巢置于含DBP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)胎鼠卵巢中的rec8、smc1β、smc3的mRNA表達(dá)水平顯著降低[22]。因此檢測(cè)PFOA是否可以影響減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFOA顯著下調(diào)卵巢組織中rec8、smc1α、smc1β、smc3 mRNA的表達(dá)。80，120 mg/kg的LBP可以提高rec8、smc1α、smc1β、smc3 mRNA 水平，說明其對(duì)PFOA造成的生殖損傷有緩解作用。

PFOA可以通過減少SOD、CAT、T-AOC的水平，增加ROS、MDA含量導(dǎo)致子代雌鼠卵巢組織的損傷。還可以降低血清中的FSH、LH、GnRH含量，升高E2水平，提高卵巢組織中ERα、ERβ含量，下調(diào)卵巢組織中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，而LBP可以緩解PFOA造成的子代雌鼠卵巢損傷。