任雨龍，李暢洋，孫 愉，張 昊，魏 笑，高炳南，王秋菊

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia,SMA)，屬于黃單胞菌科，寡養(yǎng)單胞菌屬，是一種嚴格需氧，能夠感染人和動物的致病菌。該菌通常能夠引起奶牛的呼吸道感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和菌血癥等[1]。臨床表現(xiàn)為采食量、產(chǎn)奶量下降，高熱，呼吸急促同時伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴重的會引發(fā)多器官衰竭，甚至死亡[2-3]。

隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的廣泛應用，SMA的耐藥性給感染后的治療帶來了極大的困難。由于該菌在動物臨床上的致病性不如其他病原體，故對其生物學特性、存在的毒力和耐藥基因，以及耐藥表型的研究報道少見[4]。目前，關(guān)于豬源、人源和魚源SMA的研究均有報道，但關(guān)于牛源SMA的試驗研究較少[5-7]，且并未對該菌的毒力、耐藥等特性進行系統(tǒng)分析，臨床上參照豬源或人源等分離菌株的生長特性以及耐藥特性等信息，對奶牛SMA感染進行防治，不具有充分的指導意義。

因此，為進一步了解牛源SMA的生化特性、毒力和耐藥特征，本試驗通過從荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)分離出目標菌株，并對其生長特性和耐藥表型等信息進行分析，旨在豐富牛源SMA的生物學信息特征，為科學防治SMA的感染以及合理用藥提供幫助，以期減少SMA感染所帶來的經(jīng)濟損失，增加奶牛養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益。

1 材料與方法

1.1 樣品采集在黑龍江省大慶市某規(guī)?；B(yǎng)殖場選取12頭荷斯坦奶牛，其中高產(chǎn)奶牛6頭，健康狀況良好，采食量正常。低產(chǎn)奶牛6頭，呼吸急促，采食量相對較少。一共采集12份瘤胃內(nèi)容物，置于37℃泡沫保溫箱中保存，迅速帶回實驗室進行后續(xù)試驗，采樣奶牛信息如表1所示。

表1 采樣奶牛信息

1.2 主要試劑與儀器血瓊脂基礎(chǔ)2號(HB6230)、MH肉湯(NB6231)、MH瓊脂(HB6232)、LB肉湯(HB0128)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(HB0177-1)購自青島海博公司；Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖購自TaKaRa公司；細菌DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；氨芐西林、紅霉素、克拉霉素等14種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；質(zhì)控菌株嗜酸乳桿菌ATCC4356購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.3 細菌的分離培養(yǎng)將瘤胃內(nèi)容物使用無菌醫(yī)用紗布過濾掉飼料殘渣，為了后期方便挑取菌落，用生理鹽水稀釋至不同的濃度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，取10-6，10-7，10-83個濃度在血平板上均勻涂布，置于37℃常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3個重復。每隔12 h進行挑菌操作，將菌落用劃線法接到新培養(yǎng)基平皿中，重復此步驟4～5次，直至平皿中菌落完全相同，沒有雜菌。

1.4 DNA提取及測序取分離純化后的菌液，利用DNA提取試劑盒提取細菌DNA，添加細菌通用引物，進行PCR擴增，其中上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。預期擴增產(chǎn)物目的基因大小為1 500 bp左右，引物由上海生物工程公司完成[8]。

25 μL反應體系：Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 延伸30 s，30個循環(huán);最后72℃ 延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預期基因大小的樣品送至上海生物工程公司進行測序，再將測序結(jié)果與GenBank中已經(jīng)登錄的菌株進行同源性比對分析，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 生化特性試驗將所有分離的純化菌株接種到硝酸鹽還原、甲基紅、靛基質(zhì)、硫化氫、尿素酶等生化特性培養(yǎng)基中，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基的配制以及鑒定方法主要參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第九版和《微生物學及檢驗技術(shù)實驗指導》。

1.6 溫度特性結(jié)合序列比對與生化特性試驗結(jié)果，從分離的17株菌中挑出4株SMA進行生化特性分析。從各菌株培養(yǎng)液中抽取20 μL菌液于980 μL LB液體培養(yǎng)基中，以LB液體培養(yǎng)基為對照，置于搖床內(nèi)150 r/min，分別在32，34，36，37，38，40℃下培養(yǎng)24 h，每個溫度做3個重復，利用酶標儀測定D600值，以溫度(℃)為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制溫度曲線。

1.7 耐酸堿特性同1.3接菌方法，在pH值分別為3，4，5，6，7，8，9的LB培養(yǎng)基中接菌，每個酸堿度做3個重復，置于搖床內(nèi)150 r/min，培養(yǎng)24 h，測定D600值。以pH值為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制耐酸耐堿特性曲線。

1.8 耐膽鹽特性將接種菌液的無膽鹽LB培養(yǎng)基作為空白對照組，膽鹽濃度分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%為試驗組，每個膽鹽濃度3個重復，置于搖床內(nèi)150 r/min，37℃，培養(yǎng)24 h后，測定D600值，并以膽鹽濃度作為橫坐標，培養(yǎng)液吸光度值為縱坐標繪制曲線。

1.9 藥敏試驗本試驗以嗜酸乳桿菌ATCC4356為質(zhì)控菌株，將各菌株接種到MH肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，抽取100 μL菌液置于MH瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布。將各類藥敏紙片緊密貼于平皿中，倒置培養(yǎng)24 h后，記錄抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果參照美國臨床實驗室標準化委員會NCCLS(2013)公布的標準，做出耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)的判定[9-10]。

1.10 毒力基因測定選擇與奶牛常見疾病關(guān)系較為密切的毒力基因mrkD、fimH和wabG為檢測基因，以添加特異性引物的菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物為樣品，檢測菌株中存在毒力基因的種類[11](表2)。

表2 毒力基因引物信息

1.11 耐藥基因的檢測參考相關(guān)文獻[12]，并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，從GenBank中檢索到有關(guān)耐藥基因的序列，獲得鏈霉素類、碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類等耐藥基因序列信息，利用DNAStar Lasergene 11.0 查找出各基因序列中的保守序列，在NCBI上設(shè)計引物，得到6類7種耐藥基因的引物序列(表3)。

表3 耐藥基因引物信息

1.12 菌株致病性檢測選取健康BALB/c小鼠35只，SPF級，4周齡，體質(zhì)量21～24 g，分為5組，每組7只。對照組小鼠灌喂LB液體培養(yǎng)基，剩余4組分別灌喂?jié)舛葹?×1011CFU/mL的SMA PMIK-2-a、PMIK-2-b、PMIK-2-c、PMIK-2-d菌液，灌喂量為300 μL/只，持續(xù)灌喂7 d，自由飲水，觀察小鼠健康狀況[13]。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)如圖1所示，分離菌株在TSA瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色，略凸起，圓形的點狀菌落。鏡檢觀察，菌體為直或者略彎曲的桿狀形態(tài)，為革蘭陰性桿菌。

圖1 分離株在TSA瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)(A)及革蘭染色結(jié)果(B)

2.2 PCR擴增產(chǎn)物檢測提取菌株DNA，進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)目的基因片段大小為1 500 bp左右，與預測基因片段大小相符(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.16S rDNA擴增產(chǎn)物

2.3 基因序列比對將測序結(jié)果在NCBI的GenBank中進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)所有分離菌株的同源性均在99%以上，初步確定分離菌株為SMA PMIK-2。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹利用MEGA7.0軟件將測序結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步證明試驗所篩選出來的菌與GenBank比對結(jié)果的準確性，同源性達到100%(圖3)。

K7為目標菌株序列；發(fā)育樹節(jié)點的數(shù)值代表Bookstrap值；編號數(shù)值為GenBank數(shù)據(jù)庫的登錄號

2.5 生化特性鑒定本研究主要對所分離的17株菌進行革蘭染色、硝酸還原、靛基質(zhì)(吲哚)、產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接觸酶以及發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)硫化氫等特性鑒定(表4)。參照伯吉氏系統(tǒng)細菌學手冊第9版，檢測結(jié)果基本符合SMA的生化特性。

表4 分離菌株生化特性鑒定

2.6 溫度特性在不同溫度條件下，4株SMA PMIK-2的生長狀況相似，均在培養(yǎng)溫度為38℃時，吸光度值達到最高，即菌群數(shù)量達到最大。而隨著溫度繼續(xù)升高，菌群數(shù)量開始迅速下降，即38℃為PMIK-2的最佳生長溫度(圖4)。

圖4 SMA PMIK-2溫度曲線

2.7 耐酸堿特性不同的培養(yǎng)基酸堿度對SMA PMIK-2的生長影響是不同的。當培養(yǎng)基pH在3.0～7.0之間時，PMIK-2的生長數(shù)量處于穩(wěn)定上升的狀態(tài)。當pH=7.0時，SMA PMIK-2菌群數(shù)量達到峰值，若培養(yǎng)基pH值繼續(xù)增加，菌群數(shù)量開始快速降低，說明PMIK-2的最佳生長pH值為7.0(圖5)。

圖5 SMA PMIK-2耐酸堿特性曲線

2.8 耐膽鹽特性隨著膽鹽濃度的增加，SMA PMIK-2的數(shù)量開始下降，當膽鹽濃度在0.5%～1.5%時，菌群數(shù)量下降較為迅速，繼續(xù)增加膽鹽濃度，菌群數(shù)量繼續(xù)下降。但當膽鹽濃度達到2%時，菌群數(shù)量依然大于對照組的50%，說明SMA PMIK-2具有較強的膽鹽耐受能力(圖6)。

圖6 SMA PMIK-2耐膽鹽曲線

2.9 藥敏試驗SMA PMIK-2在所使用的14種抗菌藥物中，對卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢唑啉、克拉霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星高度敏感，對多西環(huán)素中度敏感，對鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物不敏感(表5)。

表5 藥敏試驗結(jié)果

2.10 毒力基因檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測SMA PMIK-2的PCR擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)fimH、mrkD和wabG3種毒力基因在PMIK-2菌株均被檢出(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.mrkD基因;2.fimH基因;3.wabG基因

2.11 耐藥基因檢測同2.9檢測方法，檢測SMA PMIK-2的PCR擴增產(chǎn)物，在PMIK-2的基因中檢測到鏈霉素、碳青霉烯類和四環(huán)素類耐藥基因，與藥敏試驗結(jié)果相符(圖8)。

M.DL2000 Marker;1.AadA1基因;2.BlaSHV-1基因;3.ErmF基因;4.TetD基因;5.TetA基因;6.Sul 1基因;7:GyrA基因

2.12 菌株致病性檢測隨著灌喂天數(shù)以及菌液濃度的增加，小鼠死亡率出現(xiàn)不同程度的上升，灌喂1.0×107,1.0×109,1.0×1011CFU/mL組濃度的死亡率分別為28.6%～42.9%，42.9%～57.1%，71.4%～85.7%。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)胸腔，肝臟、胃腸道均存在不同程度的出血現(xiàn)象。除LB組外，各組剩余存活小鼠體質(zhì)量、采食量和飲水量均較灌喂前下降，且精神萎靡，運動能力大幅度下降，出現(xiàn)畏寒扎堆的現(xiàn)象(表6)。

表6 SMA PMIK-2致病性檢測

3 討論

本研究從荷斯坦奶牛的瘤胃內(nèi)分離到17株SMA PMIK-2，其中高產(chǎn)奶牛組4株，低產(chǎn)奶牛組13株。從中挑選出4株同源性存在差異的PMIK-2，對其生物學特性、耐藥性、耐藥基因和毒力基因等進行檢測分析。

參照伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第9版，分離菌株P(guān)MIK-2的生化特性鑒定結(jié)果與菌種屬基本一致。在本試驗中甲基紅特性檢測結(jié)果為陰性，與其他報道結(jié)果不一致，說明PMIK-2的生長繁殖不能以葡萄糖為營養(yǎng)原料，這可能是由于菌株來源不同導致的[14-15]。

目前諸多對SMA的研究中，少見對其溫度、耐酸堿以及耐膽鹽特性的報道。而在本試驗中發(fā)現(xiàn)PMIK-2的最適生長溫度為38℃，最佳生長pH為7.0，具有較強的耐膽鹽能力。當膽鹽濃度增加到2.0%時，菌群生長數(shù)量在對照組的50%以上，說明SMA PMIK-2具有較強的耐受能力，能夠通過奶牛瘤胃并在腸道中存活。

有研究發(fā)現(xiàn)豬源和人源SMA的耐藥檢出種類具有相似性，對慶大霉素、氧氟沙星、四環(huán)素和氨芐西林均呈現(xiàn)高度耐藥性[16]。這可能是因為2種來源的SMA均為革蘭陰性菌，且在一些相同種類的抗生素藥物的長期作用下，形成了較為相似的耐藥譜型[17]。豬源SMA呈現(xiàn)多種藥物耐藥性是由于養(yǎng)殖場內(nèi)廣泛使用一些磺胺類等藥物作為飼料添加劑導致的，而人源SMA的多種耐藥性可能是人醫(yī)臨床上對該菌感染的治療，長期使用多種抗生素藥物引起的[18]。人源和豬源SMA的耐藥表型與本試驗結(jié)果略有差異。本試驗中SMA PMIK-2僅對鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物存在高度耐藥性，而對卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢唑啉、克拉霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等抗生素藥物高度敏感，這可能是由于奶牛養(yǎng)殖場長期使用的藥物與其他地點不同造成的。

在PMIK-2中檢出的AadA1、BlaSHV-1和TetD3種耐藥基因與藥敏試驗結(jié)果相符。還有研究在SMA的基因中檢測到了fim、mrkD毒力基因以及BlaSHV-1和TetD耐藥基因，這與本試驗結(jié)果相同[19]。此外，在PMIK-2的基因中還檢出了wabG毒力基因，結(jié)合小鼠灌喂試驗結(jié)果，表明SMA PMIK-2對BALB/c小鼠有較強的致病性。因此，在本試驗中，分離PMIK-2菌株數(shù)量的差異有可能是2組奶牛生產(chǎn)狀況不同的原因之一。

在臨床治療中，通常針對菌株所具有的毒力，以及攜帶的耐藥基因來決定使用藥物的種類[20]。因此，在治療SMA PMIK-2引起的疾病時，使用鏈霉素、碳青霉烯類和四環(huán)素類藥物的治療效果可能不是十分理想。

此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在SMA的耐藥性與耐藥基因的檢測結(jié)果之間存在差異，可能是除基因耐藥以外的其他耐藥機制引起，比如細菌細胞壁通透性的改變、細菌表達外排泵造成藥物的外排等原因[21]。在PCR試驗中，模板、試劑和焦磷酸鹽分子的聚集等因素也會導致在定量方面結(jié)果不夠準確，容易產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，從而出現(xiàn)耐藥基因與耐藥表型不一致的情況[16]。

綜上所述，SMA PMIK-2的最適生長為38℃，最佳生長pH為7.0，具有較強的耐膽鹽能力。其基因中攜帶毒力基因fimH、mrkD和wabG，以及耐藥基因AadA1、BlaSHV-1和TetD。PMIK-2對鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物高度耐受，且具有較強的致病性。在奶牛的養(yǎng)殖過程中應當注意SMA PMIK-2的預防以及治療，在臨床治療時應該避免使用具有耐受性的藥物，同時還要注意多種藥物合理搭配使用，這樣才能避免更多耐藥菌株的產(chǎn)生，從而減少SMA感染所帶來的經(jīng)濟損失。