趙靜雯，邵 雯，徐 崇，吳欣悅，3，李雅梅，楊 奕，徐天樂(lè)，3，楊章平，3*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.上海申普獸醫(yī)技術(shù)有限公司，上海 201512;3.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇 揚(yáng)州 225000；4.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

奶牛臨床乳腺炎整體發(fā)病率較高，對(duì)奶牛健康、產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)均造成嚴(yán)重危害，且目前主流的抗生素治療也面臨著細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留等問(wèn)題，制約著產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1-4]。本研究采集江蘇不同地區(qū)牧場(chǎng)臨床乳腺炎奶樣316份，開(kāi)展病原菌流行病學(xué)調(diào)查，利用細(xì)菌培養(yǎng)和16S rDNA PCR等方法對(duì)乳樣中優(yōu)勢(shì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，同時(shí)，采用K-B藥敏試驗(yàn)測(cè)定葡萄球菌耐藥表型并分析其多重耐藥特性。旨在闡明江蘇地區(qū)奶牛臨床乳腺炎病原菌流行情況，分析奶牛乳腺炎源葡萄球菌耐藥特性，從而為有效降低奶牛臨床乳腺炎發(fā)病率以及科學(xué)防治提供試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 奶樣的收集及其方法于2020年4-12月，選擇蘇北(泗洪、新沂、淮安)、蘇中(泰州、鹽城)、蘇南(張家港)7個(gè)規(guī)模化牧場(chǎng)，采集的臨床乳腺炎奶樣共計(jì)316份。采樣前棄掉每個(gè)乳頭的頭3把奶，采集每1個(gè)乳頭的乳汁，酒精消毒乳頭周圍，由遠(yuǎn)及近地消毒每個(gè)乳頭，清潔15 s，晾干10 s。采樣時(shí)：先從近端乳頭開(kāi)始收集牛乳，采集時(shí)注意盡量保持水平不要污染集乳瓶，采樣量約40 mL。樣品采集完成后密封采樣瓶，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室分析；采樣瓶上編寫牛號(hào)，另附紙質(zhì)采樣單寫明牧場(chǎng)名稱、采樣時(shí)間，采樣單序號(hào)與牛號(hào)相對(duì)應(yīng)。

1.2 試驗(yàn)試劑哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：HB0124；無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自鄭州九龍生物制品有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和溶菌酶購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，型號(hào)：DP302；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，貨號(hào)：75510019；2×Taq Master Mix(Dye Plus)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL5000 DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Mueller-Hinton瓊脂購(gòu)自青島高科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：HB6232；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，青霉素G(10 μg/片，貨號(hào)：S1001)，阿莫西林(20 μg/片，貨號(hào)：S1061)，苯唑西林(1 μg/片，貨號(hào)：S1002)，慶大霉素(10 μg/片，貨號(hào)：S1028)，四環(huán)素(30 μg/片，貨號(hào)：S1036)，林可霉素(2 μg/片，貨號(hào)：S1053)，環(huán)丙沙星(5 μg/片，貨號(hào)：S1050)，氯霉素(30 μg/片，貨號(hào)：S1063)；麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：YA0180。

1.3 細(xì)菌分離與純化取乳腺炎奶樣50～100 μL均勻涂布于血平板，37℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)15 min，待奶漬干燥后正置過(guò)夜培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌顏色、形狀、溶血性等表觀特性做好記錄。接種針挑取單菌落接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8～12 h。接種環(huán)蘸取渾濁菌液，于LB瓊脂上劃線培養(yǎng)(分區(qū)劃線、連續(xù)劃線)，然后用接種針挑取單菌落振蕩培養(yǎng)8～12 h。

1.4 病原菌基因組DNA提取TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒提取分離單一菌株的全基因組DNA。

1.5 PCR反應(yīng)體系與程序PCR采用50 μL反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 22.5 μL；上、下游引物各2.0 μL(10 μmol/L)；細(xì)菌基因組DNA 1.0 μL；RNase-free H2O2，22.5 μL補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 1 min。PCR引物見(jiàn)表1。

表1 病原菌擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA通用引物

1.6 電泳與測(cè)序鑒定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點(diǎn)入瓊脂糖凝膠(1%)上進(jìn)行電泳，恒壓120 V，25 min后將凝膠放置凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。取1 500 bp PCR產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收后進(jìn)行測(cè)序(南京擎科生物科技有限公司)。測(cè)序結(jié)果在NCBI上與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確定病原菌種屬。

1.7 細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的菌落到滅菌生理鹽水，調(diào)節(jié)其濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。滅菌棉簽沾取菌懸液，均勻涂布? cm M-H培養(yǎng)基平板上，菌液吸附數(shù)分鐘后，再用滅菌鑷子將藥敏紙片逐一貼于培養(yǎng)基的表面，37℃培養(yǎng)18 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑并記錄。結(jié)合2013版CLSI判讀標(biāo)準(zhǔn)，將所有菌株試驗(yàn)結(jié)果分為敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)。

2 結(jié)果

2.1 奶牛臨床乳腺炎乳樣致病菌分離情況本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和16S rDNA鑒定相結(jié)合，對(duì)采集到的316份臨床乳腺炎乳樣進(jìn)行致病菌分離鑒定。結(jié)果顯示，共有274份乳樣長(zhǎng)出細(xì)菌，42份奶樣未得到可用于分離鑒定的細(xì)菌，其中31份無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，11份乳樣被污染，樣品得菌率為86.71%(表2)。

表2 316份臨床乳腺炎奶樣致病菌分離情況

2.2 乳腺炎致病菌感染模式分析分析細(xì)菌感染模式發(fā)現(xiàn)，在有細(xì)菌生長(zhǎng)的274份奶樣中，單種細(xì)菌感染的乳樣數(shù)量為86份，單菌感染率為31.39%；多種細(xì)菌感染的奶樣數(shù)量為188份，混合感染率為68.61%(圖1)。

圖1 274份陽(yáng)性樣本病原菌感染模式

2.3 奶牛臨床乳腺炎源致病菌種類分析274份奶樣中共分離出細(xì)菌453株，經(jīng)鑒定得到結(jié)果如下：共分離出葡萄球菌屬132株，占分離株總數(shù)的39.13%，包括腐生葡萄球菌31株、產(chǎn)色葡萄球菌29株、松鼠葡萄球菌20株、金黃色葡萄球菌13株、溶血葡萄球菌11株、模擬葡萄球菌10株和其他種屬葡萄球菌18株；克雷伯菌屬80株，占分離株總數(shù)的17.66%，包括肺炎克雷伯菌72株、產(chǎn)酸克雷伯菌8株；大腸桿菌52株，占分離株總數(shù)的11.48%；芽孢桿菌屬69株，占分離株總數(shù)的15.23%(圖2)。另外還有一些常見(jiàn)的奶牛乳腺炎病原菌因數(shù)量較少，本研究將其納入其他種屬中，包括鏈球菌屬(主要為無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌)、綠膿桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和腸球菌。

圖2 453株分離株微生物多樣性分析

2.4 103株葡萄球菌對(duì)8種抗生素耐藥表型分析從圖3可以看出，江蘇地區(qū)奶牛乳腺炎葡萄球菌分離株對(duì)除環(huán)丙沙星外的7種抗生素均產(chǎn)生了一定的耐藥性，耐藥率為2.6%～82.5%，其中對(duì)林可霉素耐藥最為嚴(yán)重，耐藥率達(dá)82.5%，其次是β-內(nèi)酰胺類的苯唑西林、青霉素、阿莫西林，耐藥率分別達(dá)到67.6%，57.5%，43.2%。對(duì)慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素較為敏感，耐藥率為8.1%，5.4%，2.7%。試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的菌株，但中度敏感的菌株比例較高，達(dá)27%。

圖3 103株葡萄球菌耐藥表型比例

2.5 103株葡萄球菌的多重耐藥性情況從圖4可以看出，江蘇地區(qū)奶牛乳腺炎葡萄球菌分離株呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，其中3重耐藥最多，為35株，占比達(dá)33.98%；其余依次為4重耐藥、2重耐藥、5重耐藥，分別為21，16，14株，另外還有9株6重耐藥。其中多以耐β-內(nèi)酰胺類抗生素居多，說(shuō)明江蘇地區(qū)奶牛乳腺炎葡萄球菌分離株以耐β-內(nèi)酰胺類抗生素為主的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

圖4 103株葡萄球菌對(duì)8種抗生素的多重耐藥情況

3 討論

在許多地區(qū)，環(huán)境型機(jī)會(huì)病原菌已成為奶牛發(fā)生臨床乳腺炎的最常見(jiàn)原因[5]。OLIVEIRA等[6]研究則顯示大腸桿菌和克雷伯菌屬是最主要的兩種環(huán)境型機(jī)會(huì)病原菌。進(jìn)一步查閱資料發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌引起的臨床乳腺炎通常以基于急性的和有效免疫反應(yīng)的短期臨床乳腺炎為特征[7-8]。相反，由克雷伯菌屬引起的臨床乳腺炎與長(zhǎng)期亞臨床乳腺炎以及臨床預(yù)后較差有關(guān)[9]。在探究江蘇地區(qū)克雷伯菌屬高流行率的原因時(shí)發(fā)現(xiàn)，本研究選取的牧場(chǎng)大部分采用木屑、鋸末作為奶牛墊料，而根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)告顯示木屑、鋸末墊料中克雷伯菌屬的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沙子墊料[10-12]，且也有研究報(bào)道使用新鮮的沙層來(lái)控制乳腺炎的益處[13]。因此，對(duì)于克雷伯菌屬高發(fā)的牧場(chǎng)來(lái)說(shuō)，提高牧場(chǎng)衛(wèi)生條件的同時(shí)，更換沙子墊料可能是個(gè)不錯(cuò)的選擇。

本研究中檢測(cè)的酵母菌主要為白色念珠菌(白色假絲酵母菌)，是一種條件致病菌，在機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)，白色念珠菌以不致病的狀態(tài)維持寄生的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)平衡被打破，白色念珠菌便開(kāi)始產(chǎn)生致病性，對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生影響；另外白色念珠菌具有很強(qiáng)的傳染性，由其引起的乳腺炎與其他原因引起的乳腺炎之間并無(wú)明顯區(qū)別，故往往被忽視[14]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于白色念珠菌引起的乳腺炎的相關(guān)報(bào)道一直存在，引起廣泛關(guān)注。本研究中白色念珠菌主要在5、6月份檢出，這與唐國(guó)春[15]的結(jié)果一致，可能是因?yàn)榇藭r(shí)天氣悶熱多雨，適合霉菌生長(zhǎng)。因此建議對(duì)于白色念珠菌高發(fā)的牧場(chǎng)，臨近這個(gè)季節(jié)，應(yīng)做好牛場(chǎng)清潔工作，定期對(duì)擠奶工具、醫(yī)療器械等進(jìn)行消毒，防止該菌流行。

牛支原體通常被分類為一種傳染性乳腺炎病原體,牛群之間的傳播主要發(fā)生在擠奶時(shí)[16-18]。通常會(huì)引起亞臨床或輕度的臨床乳腺炎，嚴(yán)重的臨床乳腺炎暴發(fā)也可能發(fā)生[19-20]。此外牛支原體乳腺炎不能用抗生素治療。本研究中牛支原體的檢測(cè)結(jié)果多為弱陽(yáng)性，說(shuō)明其不是引起奶牛乳腺炎的優(yōu)勢(shì)病原菌，但較高的檢出應(yīng)引起牧場(chǎng)注意?，F(xiàn)階段針對(duì)牛支原體的控制策略是保持牛群不受感染，并及時(shí)隔離感染的奶牛，防止大規(guī)模傳播[21-22]。

通過(guò)分析103株奶牛乳腺炎源葡萄球菌的藥敏結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，目前江蘇地區(qū)奶牛乳腺炎源葡萄球菌對(duì)林可霉素、β-內(nèi)酰胺類藥物表現(xiàn)出極高的耐藥性；另一方面，雖然這些分離菌株對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星等其他抗生素表現(xiàn)出較高的敏感性，但中度敏感的卻不在少數(shù)，有進(jìn)一步發(fā)展為耐藥的趨勢(shì)。通過(guò)查閱資料，發(fā)現(xiàn)江蘇地區(qū)乳腺炎源病原菌對(duì)林可霉素、β-內(nèi)酰胺類抗生素一直保持著較高的耐藥率。江靜宜[23]對(duì)江蘇3個(gè)牧場(chǎng)分離出的病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，幾乎所有分離菌對(duì)林可霉素和β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林、青霉素耐藥，而對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素和鏈霉素敏感。馮清[24]的結(jié)果顯示，江蘇部分地區(qū)分離出的114葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素G的耐藥率最高，達(dá)75.18%。林偉東[25]對(duì)江蘇5個(gè)規(guī)?；翀?chǎng)分離的393株葡萄球菌的研究結(jié)果顯示，84.73%的葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥，是耐藥性最強(qiáng)的抗菌藥物。此外，在實(shí)地采樣與牧場(chǎng)獸醫(yī)交流時(shí)得知，林可霉素、青霉素、頭孢菌素是牧場(chǎng)一線用藥，這也解釋了為什么江蘇地區(qū)乳腺炎源病原菌對(duì)這些藥物表現(xiàn)出高耐藥率。

綜上，江蘇地區(qū)部分牧場(chǎng)乳腺炎的發(fā)病率仍然較高，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果揭示了乳腺感染多以葡萄球菌屬和肺炎克雷伯菌為主要致病菌。其中，葡萄球菌屬的耐藥表型以多重耐藥為主(三重)，結(jié)果證明，在抗生素使用廣泛的牧場(chǎng)，耐藥致病菌的產(chǎn)生是導(dǎo)致乳腺炎發(fā)病率高且難以治愈的主要原因之一，研究數(shù)據(jù)可為有效降低奶牛臨床乳腺炎發(fā)病率以及科學(xué)防治提供試驗(yàn)支撐。