邱佳輝，蔡謙謙，楊 彥，程非池，裘正軍#，黃 陳#

1.南京醫(yī)科大學附屬上海一院臨床醫(yī)學院，上海 211166；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院胃腸外科，上海 201600

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，2020年全球新增CRC患者約193萬人，占新增癌癥總人數(shù)的10%，位居世界第三位；新增CRC 相關死亡患者約93.5 萬人，占新增癌癥死亡總人數(shù)的9.4%，居世界第二位［1］。據(jù)中國國家癌癥中心2022 年發(fā)布的癌癥研究報告顯示，CRC 的發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤的第二位和第四位［2］。目前國際公認的CRC 分期標準是腫瘤-淋巴結-轉移（tumor-node-metastasis，TNM）病理分期系統(tǒng)。根據(jù)TNM 分期系統(tǒng)制定治療計劃，仍有許多患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)轉移，且同一病理分期患者的預后也存在差異。因此，需要有新的指標對TNM 分期系統(tǒng)進行補充和完善，以指導CRC患者的治療。

脈管浸潤（lymphovascular invasion，LVI）是指腫瘤侵犯血管和淋巴管。大量研究表明LVI 與CRC的不良預后有關，文獻［3-4］報道CRC中LVI陽性率為5.2%～30.3%。神經(jīng)浸潤（perineural invasion，PNI）是指腫瘤細胞沿著神經(jīng)纖維方向生長并且包繞神經(jīng)纖維周長33.3%以上，或腫瘤細胞浸潤神經(jīng)纖維的神經(jīng)鞘進入神經(jīng)束膜內(nèi)。研究表明PNI 是影響CRC 患者預后的獨立危險因素，陽性率約為18.2%［5-6］。腫瘤間質(zhì)比（tumor-stroma ratio，TSR）是指腫瘤組織內(nèi)腫瘤實質(zhì)和腫瘤間質(zhì)的面積比值， 最早由MESKER［7］提出，發(fā)現(xiàn)該指標能預測CRC 的預后。我們研究發(fā)現(xiàn)LVI陽性、PNI陽性、高TSR的CRC是一類發(fā)生率低但預后不良的CRC。本研究探討了神經(jīng)脈管浸潤聯(lián)合TSR 評估CRC 預后的作用，并挖掘其在CRC預后預測中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014 年1 月—2018 年12 月在上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院（Shanghai General Hospital，SGH）行普外科手術，術后病理標本檢查明確診斷是CRC 的患者948 例，對患者的臨床信息、病理資料和隨訪結果等數(shù)據(jù)進行回顧性分析，同時收集組織芯片（tissue microarray，TMA）隊列的106 例CRC病理樣本進行驗證。

納入標準：①年齡≥18 周歲，具有自主行為能力。②行根治性手術切除。③手術標本經(jīng)病理學診斷后確診為CRC。④患者擁有完整的可供分析使用的臨床病理資料和隨訪數(shù)據(jù)。排除標準：①術前曾行新輔助治療或其他抗腫瘤治療。②既往有CRC 病史或曾經(jīng)患有其他惡性腫瘤［8］。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H-E）染色試劑購自上海生物試劑公司，石蠟切片機購自德國徠卡公司，KF-PRO-120 數(shù)字切片掃描儀購自中國寧波江豐生物信息技術有限公司。

1.2.2 病理切片制作 術中取出的標本用福爾馬林溶液固定，之后用石蠟將標本包埋，使用石蠟切片機將標本制成5 μm 厚的切片，再進行H-E 染色，使用數(shù)字切片掃描儀掃描切片，生成全視野數(shù)字病理切片（whole-slide image，WSI），利用K-Viewer 軟件瀏覽圖片［9］。

1.2.3 LVI 評估 LVI 是指H-E 染色切片中發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤淋巴管或者血管；腫瘤細胞周圍有明確的內(nèi)皮細胞 環(huán) 繞［10］。本 研 究948 例 患 者 中LVI 陽 性312 例，LVI陰性636例。

1.2.4 PNI 評估 PNI 是指H-E 染色切片中發(fā)現(xiàn)腫瘤侵犯鄰近的周圍神經(jīng)（腫瘤細胞沿著神經(jīng)纖維方向生長并且包繞神經(jīng)纖維周長33.3%以上），或腫瘤細胞浸潤神經(jīng)纖維的神經(jīng)鞘進入神經(jīng)束膜內(nèi)［11］。PNI 陽性257例；PNI陰性691例。

1.2.5 TSR 評估 在H-E 染色切片中選擇腫瘤侵襲最明顯的區(qū)域，首先放大20 倍使圖片可視化，然后選擇具有代表性的區(qū)域進一步放大至40 倍，選擇的區(qū)域需確保四周均有腫瘤實質(zhì)，將腫瘤間質(zhì)盡可能多的區(qū)域作為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），評估TSR 數(shù)值（如果評分視野內(nèi)包含黏液壞死組織，要將黏液壞死組織區(qū)域排除），使用MATLAB 開發(fā)的算法計算TSR 數(shù)值（我們的既往研究［12］證實算法計算的TSR 數(shù)值比人工讀取的更加準確）。本研究以算法最優(yōu)值41.3%為cut-off值，根據(jù)TSR cut-off值將患者分為“高TSR 組”（TSR＞41.3%）和“低TSR 組”（TSR≤41.3%）［12］。高TSR 474例，低TSR 474例。

1.3 隨訪

所有CRC 患者通過門診或電話等方式進行隨訪，術后2年內(nèi)每3個月進行一次隨訪，術后3～5年每6個月進行一次隨訪?？偵鏁r間（overall survival，OS）定義為從手術日至死亡日（全因死亡）或隨訪結束日，隨訪結束日期為2019年7月。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用表示，采用t檢驗；不滿足正態(tài)分布的資料用M（Q1，Q3）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗；定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher 確切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier 法，顯著性分析采用Log-rank 檢驗。采用單因素和多因素COX 回歸模型確定影響預后的獨立危險因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CRC的分組依據(jù)

研究結果發(fā)現(xiàn)：隨著PNI、LVI 和TSR 等高危因素疊加，CRC 不良預后的風險顯著提高（P=0.023，P=0.003，P=0.001；表1）；且隨著高危因素的累積，患者總體預后越差（HR：3.564＞2.604＞2.037）；患者術后死亡風險隨著高危因素的疊加而不斷提升（P=0.000，圖1）。因此本研究將LVI、PNI、TSR 這3 個指標均呈現(xiàn)陽性者歸為高風險組（即LVI 陽性、PNI陽性、高TSR），其余為低風險組。

圖1 CRC的Kaplan-Meier生存分析曲線Fig 1 Kaplan-Meier survival analysis for CRC

表1 CRC總體生存率影響因素的單因素和多因素COX分析Tab 1 Univariate and multivariate COX analysis of influencing factors for overall survival of CRC

2.2 高風險組CRC的臨床病理特征分析

研究入組的948 例患者中，T1 期38 例，T2 期148例，T3期202例，T4期560例；N0期583例，N1期221 例，N2 期144 例；年齡24～89 歲，中位年齡66.0 歲，其中≤67 歲525 例，＞67 歲423 例；男性548例，女性400 例；高分化82 例，中分化729 例，低分化137 例；腫瘤長徑≥5 cm 358 例，＜5 cm 590 例；右半結腸308例，左半結腸257例，直腸383例；LVI陽性312 例，LVI 陰性636 例；PNI 陽性257 例，PNI 陰性691 例；高TSR 474 例，低TSR 474 例；高風險組81例，低風險組867例。其中高風險組患者，腫瘤分化更差（P=0.037）；隨著TNM 分期的增加患高風險CRC 的危險也隨之增高（P=0.000），且當腫瘤浸潤程度增加，PNI、LVI 和高TSR 的發(fā)生風險也隨著增加（P=0.014）；當CRC 發(fā)生淋巴結轉移時，高風險CRC 的發(fā)生風險顯著增加（P=0.000）；男性CRC 患者比女性更易發(fā)生神經(jīng)脈管浸潤和高TSR （P=0.009，表2）。

表2 高風險與低風險患者臨床病理因素相關分析［n（%）］Tab 2 Correlation analysis of clinicopathological factors between high-risk and low-risk patients［n（%）］

續(xù)表

2.3 CRC的風險因素分析

將單因素COX分析結果中的危險因素納入多因素COX比列風險模型后，我們發(fā)現(xiàn)高風險組患者預后顯著更差，高風險分組指標是影響CRC預后的獨立危險因素（表3）?？紤]到回顧性研究中混雜因素對研究結果的干擾，使用SPSS軟件進行1∶1的病例匹配，匹配條件：年齡差距小于6歲，T分期、N分期、腫瘤部位、性別、腫瘤大小保持一致。對低風險和高風險組CRC患者進行匹配，篩選出高風險組67例，低風險組67例。COX多因素研究發(fā)現(xiàn)，高風險分組指標是CRC預后的獨立危險因素，匹配后HR升高（2.380＞2.078），說明高風險組較未匹配前有更好的預后預測能力（表4）。對TMA數(shù)據(jù)進行單因素和多因素COX分析顯示，高風險分組指標是影響CRC預后的獨立危險因素（表5）。

表3 CRC總體生存率影響因素的單因素和多因素COX 分析（SGH未匹配隊列）Tab 3 Univariate and multivariate COX analysis of influencing factors for overall survival of CRC（Unmatched queue of SGH）

表4 CRC總體生存率影響因素的單因素和多因素COX 分析（SGH匹配隊列）Tab 4 Univariate and multivariate COX analysis of influencing factors for overall survival of CRC（matched queue of SGH）

表5 CRC總體生存率影響因素的單因素和多因素COX分析（TMA隊列）Tab 5 Univariate and multivariate COX analysis of influencing factors for overall survival of CRC（TMA cohort）

續(xù)表

2.4 CRC的生存分析

SGH 隊列中顯示，高風險組患者81 例，低風險組患者867 例，高風險組比低風險組顯示出更差的預后（P=0.000）。經(jīng)過對SGH 隊列的配對后，高風險組患者67 例，低風險組患者67 例，結果仍然顯示高風險組患者預后更差（P=0.027），以TMA 數(shù)據(jù)進行驗證發(fā)現(xiàn)，高風險CRC 仍然預后不良（P=0.012，圖2）。對不同原發(fā)部位CRC 的分層分析發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤部位中高風險組均表現(xiàn)出不良的預后。左半結腸和右半結腸的生存分析表明高風險組預后不良（P=0.003，P=0.001）。雖然直腸中高風險組未表現(xiàn)出更差的預后（P=0.065），但是生存曲線仍然可以看出高風險組不良預后的表現(xiàn)趨勢（圖3）。在對Ⅱ、Ⅲ期CRC 患者的分析表明，Ⅱ期高風險CRC 患者的預后不良（P=0.001）。在Ⅲ期患者中也有類似Ⅱ期患者的表現(xiàn)趨勢，雖然在生存分析時未表現(xiàn)出明顯的差異（P=0.123，圖4）。

圖2 高風險組與低風險組的Kaplan-Meier生存分析曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis for overall survival of high-risk group and low-risk group

圖3 高風險組與低風險組在腫瘤部位中的Kaplan-Meier生存分析曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival analysis curves in tumor site between high risk group and low risk group

圖4 高風險組與低風險組在TNM分期中的Kaplan-Meier生存分析曲線Fig 4 Kaplan-Meier survival analysis curves in TNM stage between high risk group and low risk group

2.5 高低風險組CRC的指標差異性分析

在對高風險組的術前血清腫瘤標志物（CEA、CA199、 CA125、 CA724、 CA50）、 基 因 突 變（KRAS、NRAS、BRAF）情況及錯配修復（mismatch repair，MMR）狀態(tài)的分布差異研究發(fā)現(xiàn)，高風險患者中CA199 升高（＞25 U/mL）的患者占比明顯高于低風險患者（P=0.001）。CEA 升高患者在高風險組中有比例更高的趨勢（P=0.051）。CA50、CA125、CA724 的占比在高風險組和低風險組中無明顯差異。對CRC 的KRAS、NRAS、BRAF的基因突變情況的研究發(fā)現(xiàn)，與低風險組相比，上述基因突變在高風險組中的發(fā)生概率無明顯升高或降低改變。錯配修復缺陷組（deficient mismatch repair，dMMR）與錯配修復正常組（proficient mismatch repair，pMMR）在高風險組和低風險組中的分布未見明顯差異（圖5）（錯配修復蛋白包含MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 4種，當出現(xiàn)1 個及以上表達缺失即判定為dMMR 狀態(tài)，4種均未缺失即判定為pMMR狀態(tài)［13］）。進一步進行生存分析后發(fā)現(xiàn)，當CRC 伴有PNI陽性、LVI陽性和高TSR 時，并發(fā)生CEA、CA199 升高或KRAS基因突變時，患者表現(xiàn)出更差的預后（P=0.000，圖6），術后可能需要精準化、個體化的強效治療措施，幫助患者獲得更佳的生存獲益。

圖5 高風險組與低風險組在術前血清腫瘤標志物、基因突變狀態(tài)、錯配修復基因狀態(tài)分布差異Fig 5 Distributional difference of preoperative serum tumor markers, gene mutation status and mismatch repair gene status for high-risk group and low-risk group

圖6 高風險組與低風險組Kaplan-Meier生存分析曲線Fig 6 Kaplan-Meier survival analysis curves for high risk group and low risk group

3 討論

根據(jù)現(xiàn)有的TNM分期標準，我們不難發(fā)現(xiàn)在相同TNM分期的CRC患者其預后狀況可能差別很大［14］。一些Ⅱ期CRC患者的預后比一些Ⅲ期CRC患者的預后更差，然而現(xiàn)有的TNM分期顯然不能篩選出這些患者，從而導致具有某些高危因素的Ⅱ期CRC患者得不到足夠的治療，使得預后不盡如人意［15］。

PNI 陽性、LVI 陽性和高TSR 的CRC 雖然在總的CRC中占比不高，但其惡性程度不容小覷。PNI陽性、LVI陽性和高TSR是CRC的獨立預后因素，因此在制定CRC術后的輔助治療策略時需格外關注，個體化、精準化的強效治療可能使得此類患者獲得更佳的療效。

ZHANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)對于CEA 升高的轉移性CRC患者可以耐受較大劑量嵌合抗原受體T細胞療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T），且可控制腫瘤生長。對于PNI 陽性、LVI陽性和高TSR 的高危CRC 患者，當出現(xiàn)CEA 增高且常規(guī)化學治療（化療）藥物治療不敏感時，能否考慮加用CAR-T 療法值得進一步探究。挪威學者［17］對545例CRC患者的生存回顧發(fā)現(xiàn)CA199是不良的預后指標，且對于CA199 升高聯(lián)合BRAF突變的CRC 患者其不良預后更加顯著。這值得我們思考：具有PNI陽性、LVI 陽性和高TSR 的CRC 患者，當術前發(fā)現(xiàn)CA199 升高且BRAF發(fā)生突變時，手術是第一位的嗎？術前的新輔助化療是否可以給患者帶來額外的生存獲益，或者術后早期化療聯(lián)合靶向、免疫等治療是否可以延緩腫瘤復發(fā)轉移，這需要后續(xù)的大樣本臨床隨機試驗來加以證實。KARS突變是CRC 中最常見的癌基因突變，通過激活KRAS基因相關蛋白持續(xù)刺激下游信號通路，促進CRC 患者的增殖和轉移。因此KRAS基因突變的CRC 患者預后較差［18］。對于高風險CRC患者當伴有KRAS基因突變時，是否可以采用化療聯(lián)合靶向藥物治療以提高療效，則有待觀察。

在對SGH的948例CRC患者的回顧性研究中，不難看出高風險分組CRC是CRC中不良預后的類型，其總生存率明顯低于低風險CRC組（P=0.000），且PNI、LVI和TSR的指標可以從常規(guī)病理標本診斷中得出，不需要承擔額外的醫(yī)療負擔，便于臨床應用和推廣。

CRC 的常規(guī)化療方案是卡培他濱單藥或聯(lián)合奧沙利鉑［19］。對于具有高危因素的Ⅱ期CRC 患者，指南推薦卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑的化療方案可能使患者生存獲益；對于無高危因素的Ⅱ期CRC 患者，奧沙利鉑的使用無明顯生存獲益，但可能導致化療不良反應的增加［20］。因此對于CRC 患者，識別其高危因素并早期加以治療控制可以使患者的生存獲益。對于Ⅲ期CRC 患者，指南推薦是CAPOX 或FOLFOX 方案，但對于部分Ⅲ期CRC 患者而言上述治療是不夠的，部分患者在化療期間有發(fā)生腫瘤復發(fā)轉移的可能［21］。我們的研究表明PNI、LVI 和TSR 的聯(lián)合指標是影響CRC 患者預后的獨立危險因素，PNI 陽性、LVI 陽性和高TSR 的CRC 患者的預后更差，生存時間短，與某些國外學者的研究［13］一致。我們的研究初步表明PNI、LVI 和TSR 的聯(lián)合指標對CRC 的生存判斷有指示作用，可為臨床醫(yī)師術后治療方案的制定提供一定的參考，可作為TNM 分期的補充。對于具有高危因素Ⅲ期CRC 患者早期的化療聯(lián)合免疫或者靶向治療，能否使患者生存獲益，有待進一步探索。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會的審核批注（文件號：2020KY052）。所有實驗過程均遵照《上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院標準/條例》?；仡櫺匝芯?，豁免簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of Shanghai General Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No.2020KY052，dated 08/19/2020），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of Shanghai General Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.As a retrospective study，consent letters was exempt signed.

作者貢獻/Authors'Contributions

邱佳輝、蔡謙謙、楊彥、程非池參與了實驗設計；邱佳輝參與了研究實施和數(shù)據(jù)分析；邱佳輝、裘正軍、黃陳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by QIU Jiahui，CAI Qianqian，YANG Yan and CHENG Feichi. The study was implemented by QIU Jiahui. The data was analyzed by QIU Jiahui. The manuscript was drafted and revised by QIU Jiahui，QIU Zhengjun and HUANG Chen.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-07-21

·Published online：2022-08-28

參·考·文·獻

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