胡慕妮，季林華，張昕雨，沈超琴，洪 潔，陳豪燕

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科，上海 200001；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科，上海 200127

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第五大確診的惡性腫瘤，為癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因；據(jù)估計(jì)全球每年新增CRC病例超過(guò)10萬(wàn)例［1］。CRC的發(fā)生和發(fā)展與遺傳、免疫、環(huán)境及腸道微生物等多種因素密切相關(guān)。研究［2］表明具核梭形桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）在CRC患者糞便及腫瘤組織中的豐度較正常人群明顯升高。同時(shí)Fn能夠?qū)е履c上皮細(xì)胞DNA損傷，誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)CRC的發(fā)生和發(fā)展［3-4］。CRC患者腫瘤組織中高豐度的Fn與患者不良的預(yù)后也密切相關(guān)［4］。研究CRC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的分子變化，尋找與之相關(guān)的新型生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)CRC相關(guān)研究的開(kāi)展具有重要意義。

隨著高通量技術(shù)的快速發(fā)展，多組學(xué)相關(guān)研究促進(jìn)了腫瘤相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)掘。既往研究［5］發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）組庫(kù)可以反映特定時(shí)間段內(nèi)機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞的多樣性以及機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外界刺激應(yīng)答的能力。當(dāng)患者受到某一抗原的刺激時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的T細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)單克隆或寡克隆反應(yīng)性增生，導(dǎo)致TCR 組庫(kù)多樣性有所下降［6］，這提示TCR 組庫(kù)多樣性可作為潛在的新型生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體的疾病狀態(tài)。

T 細(xì)胞受體測(cè)序（T cell receptor sequencing，TCR-seq）以T 細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或5'cDNA 末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of 5'cDNA end，5'RACE）技術(shù)擴(kuò)增決定TCR 多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining regions，CDR）；該技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)常應(yīng)用于TCR 組庫(kù)多樣性的評(píng)估中［7］。2021 年，來(lái)自哈佛大學(xué)的X Shirley Liu 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種新的算法TRUST4［8］，可以針對(duì)組織或者外周血的RNA 測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）數(shù)據(jù)挖掘免疫組庫(kù)信息；其能 與SMART-seq （switching mechanism at 5'end of the RNA transcript sequencing）和10× Genomics 平臺(tái)兼容，可用于后續(xù)進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，有助于快速準(zhǔn)確地評(píng)估TCR 序列信息，并深入研究免疫組庫(kù)與疾病間的聯(lián)系。TCR 組庫(kù)多樣性的分析主要在TCRα、β 鏈的基因水平（基因種類、頻率、克隆數(shù)量及基因組合的差異表達(dá)等）與氨基酸水平（TCR β 鏈CDR3氨基酸的種類、頻率、長(zhǎng)度分布等）上開(kāi)展［9］，通常采用的指標(biāo)包括香農(nóng)熵（Shannon entropy）、Chao1指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Hill 值等［10-11］。香農(nóng)熵用于評(píng)估T細(xì)胞克隆的多樣性，通過(guò)估計(jì)克隆型的相對(duì)數(shù)目和每種克隆型的豐度或分布反映TCR 的變異程度；香農(nóng)熵值越高，提示樣本中T 細(xì)胞克隆的多樣性越高。較高的Chao1 指數(shù)和Hill 值以及更小的Simpson指數(shù)也可反映更高的TCR 多樣性。通過(guò)分析TCR 組庫(kù)多樣性的特點(diǎn)，能夠進(jìn)一步了解機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)，從而有助于評(píng)估疾病進(jìn)展和治療效果［12］。

近年來(lái)，不少學(xué)者圍繞TCR 組庫(kù)多樣性、腫瘤狀態(tài)以及腫瘤免疫治療等相關(guān)問(wèn)題展開(kāi)研究，并揭示了其中的密切聯(lián)系，尤其在惡性黑色素細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中取得較多研究成果［13-14］。然而，TCR 組庫(kù)分析技術(shù)在CRC 中的相關(guān)研究和應(yīng)用較少。本研究利用TRUST4 算法分析53 例CRC 患者腫瘤組織及其匹配的癌周正常組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)，探究CRC 組織TCR 組庫(kù)多樣性與臨床特征以及腫瘤組織中Fn 豐度的相關(guān)性，以期為CRC 發(fā)生和發(fā)展機(jī)制研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016 年7 月—2016 年12 月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科收治的63 例行CRC 根治術(shù)患者作為研究對(duì)象。所有病例均經(jīng)病理活檢確診。收集患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤TNM 分期等臨床資料，獲取術(shù)中切除的腫瘤組織及其癌周正常黏膜組織樣本（距離腫瘤組織邊緣＞5 cm）。

1.2 研究方法

1.2.1 組織處理 在組織離體0.5 h 內(nèi)，使用生理鹽水對(duì)其進(jìn)行沖洗，隨后放入裝有RNAlater 組織保存液的10 mL 離心管中。4 ℃冰箱過(guò)夜之后使用DEPC水洗去組織表面的RNAlater，然后轉(zhuǎn)入凍存管中，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 RNA-seq以及16S rDNA測(cè)序 使用TRizol法提取63對(duì)新鮮CRC腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織的總RNA，通過(guò)RNeasy Mini Column（Qiagen，美國(guó)）以及DNA酶進(jìn)行純化，并通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。其中10對(duì)樣本的RNA完整性指標(biāo)（RNA integrity number，RIN）低于6，未達(dá)到測(cè)序平臺(tái)的最低標(biāo)準(zhǔn)，予以排除。最終對(duì)質(zhì)量合格的53 對(duì)樣本進(jìn)行深度RNA-seq，測(cè)序方案為雙端測(cè)序（pair-end 150 bp，PE150），每例樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量為10 Gb。選取16S rDNA的特定序列進(jìn)行高通量測(cè)序分析以估計(jì)細(xì)菌豐度。以純化的DNA作為模板，利用PCR擴(kuò)增特定目的片段，對(duì)回收后的PCR 純化產(chǎn)物的樣品使用Qubit dsDNA HS Assay Kit試劑盒（Life Technologies公司，美國(guó)）進(jìn)行定量檢測(cè)，最后在MiSeq高通量測(cè)序儀（Illumina公司，美國(guó)）PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 使用FastQC軟件對(duì)原始RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理，質(zhì)控處理后的序列通過(guò)HISAT2.45軟件與人類基因組序列GRCh38進(jìn)行比對(duì)，利用基因組注釋軟件GENCODE v22對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行定量分析。本研究RNA-seq 結(jié)果已上傳至基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）（GSE158559）。原始RNAseq數(shù)據(jù)利用TRUST4算法（https：//github.com/liulabdfci/TRUST4）進(jìn)行處理，獲得每個(gè)樣本的免疫組庫(kù)信息。TRUST4首先將所測(cè)測(cè)序片段（reads）比對(duì)到參考基因組上，將比對(duì)上的reads組裝成重疊群（Contig），然后根據(jù)國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)（International Immunogenetics Information System，IMGT）進(jìn)行注釋。使用FastQC軟件對(duì)16S rDNA測(cè)序樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制處理，再通過(guò)UCHIME算法去除嵌合體。利用USEARCH序列分析軟件將拼接好的標(biāo)簽（Tag）在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU信息，并基于rdp_16s_v16.fa分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.2.4 TCR 組庫(kù)多樣性評(píng)估 基于TRUST4 算法處理后的免疫組庫(kù)信息數(shù)據(jù)，使用immunarch R 進(jìn)一步對(duì)免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，采用repClonality函數(shù)比較腫瘤組織及其正常組織中克隆型的數(shù)目、不同擴(kuò)增程度克隆型的占比、不同克隆型的豐度；使用repExplore 函數(shù)比較不同長(zhǎng)度CDR3 氨基酸序列分布上克隆型數(shù)目，并利用repDiversity 函數(shù)計(jì)算多樣性指數(shù)（Chao1 指數(shù)、逆Simpson 指數(shù)、Hill 數(shù)值）。Chao1 指數(shù)、逆Simpson 指數(shù)、Hill 數(shù)值越高，TCR多樣性越高。

1.2.5 臨床特征及Fn 豐度評(píng)估 臨床特征評(píng)估納入性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤TNM 分期等因素。年齡以65 歲作為臨界值。根據(jù)腫瘤所在部位將腫瘤位置定義為直腸和非直腸。TNM 分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合 委 員 會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）結(jié)直腸癌TNM 分期第八版［15］，分為Ⅰ/Ⅱ期和Ⅳ/Ⅲ期。將性別、腫瘤位置、腫瘤TNM 分期轉(zhuǎn)化為二分類變量進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)。Fn 豐度評(píng)估使用OTU的reads數(shù)目的中位數(shù)作為臨界值，＞臨界值被定義為Fn高負(fù)荷，≤臨界值被定義為Fn低負(fù)荷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R studio（4.1.1 版）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用表示，2 組間差異比較使用t檢驗(yàn)。對(duì)于非正態(tài)分布的定量資料，采用M表示，2 組間差異比較使用Wilcoxon 檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織及癌周正常黏膜組織TCR克隆型分析

2.1.1 克隆型數(shù)目 對(duì)53 對(duì)樣本的TCR 克隆型數(shù)目進(jìn)行分析，總體上來(lái)看，腫瘤組織中克隆型數(shù)目較癌周正常黏膜組織下降（圖1A）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，腫瘤組織TCR 克隆型數(shù)目明顯少于癌周正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，圖1B），且腫瘤組織中占據(jù)免疫組庫(kù)10%的克隆型數(shù)目也低于癌周正常黏膜組織（P=0.000，圖1C）。此外，對(duì)腫瘤組織和癌周正常黏膜組織TCR β 鏈CDR3氨基酸序列不同長(zhǎng)度分布上的克隆型數(shù)目進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在不同長(zhǎng)度的CDR3序列上，腫瘤組織的克隆型數(shù)目均低于癌周正常黏膜組織（圖1D）。以上結(jié)果提示癌周正常組織TCR組庫(kù)多樣性更高。

圖1 腫瘤組織和癌周正常組織的TCR克隆型數(shù)目差異分析Fig 1 Comparison of the number of TCR clonotypes between tumor and adjacent normal tissues

2.1.2 不同擴(kuò)增水平的克隆型 將TCR 克隆型按照擴(kuò)增水平從高到低排序，分析排在前10、11～100、101～1 000、1 001～3 000、3 001～10 000、10 001～30 000、30 001～50 000位的克隆型所占的比例。腫瘤組織中擴(kuò)增水平排在前10 位的TCR 克隆型所占比例明顯高于癌周黏膜正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，圖2），提示腫瘤組織的TCR 的擴(kuò)增程度高于癌周正常黏膜組織。

圖2 腫瘤和癌周正常組織不同擴(kuò)增水平的TCR克隆型差異分析Fig 2 Comparison of proportion of TCR clonotypes with different amplification levels between tumor and adjacent normal tissues

2.1.3 不同頻率克隆型的相對(duì)豐度 進(jìn)一步分析腫瘤組織和癌周正常黏膜組織不同頻率TCR克隆型在整個(gè)克隆空間內(nèi)的相對(duì)豐度?？寺⌒偷念l率包括：稀有頻率（＞0且≤10-5）、小頻率（＞10-5且≤10-4）、中頻率（＞10-4且≤0.001）、高頻率（＞0.001且≤0.01）、超高頻率（＞0.01且≤1）。腫瘤組織和癌周正常黏膜組織中，TCR克隆型均以小頻率（＞10-5且≤10-4）和中頻率（＞10-4且≤0.001）為主。腫瘤組織中高頻率（＞0.001且≤0.01）和超高頻率（＞0.01且≤1）克隆型的相對(duì)豐度高于癌周正常黏膜組織，稀有頻率（＞0且≤10-5）和小頻率（＞10-5且≤10-4）克隆型的相對(duì)豐度低于癌周正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000，圖3）。

圖3 腫瘤和癌周正常組織不同頻率TCR克隆型的豐度差異Fig 3 Comparison of relative abundances in different TCR clonotypes with specific frequencies between tumor and adjacent normal tissues

2.2 腫瘤組織及癌周正常黏膜組織TCR 組庫(kù)多樣性指數(shù)評(píng)估

利用Chao1 指數(shù)、逆Simpson 指數(shù)以及Hill 數(shù)值曲線對(duì)腫瘤組織及癌周正常黏膜組織的TCR 組庫(kù)多樣性進(jìn)行分析比較。腫瘤組織的Chao1 指數(shù)和逆Simpson 指數(shù)均小于癌周正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000，圖4A、B）。Hill 數(shù)值曲線也顯示，腫瘤組織TCR 組庫(kù)多樣性較癌周正常黏膜組織明顯下降（P=0.000，圖4C）。

圖4 腫瘤和癌周正常組織間TCR組庫(kù)多樣性指數(shù)比較Fig 4 Comparison of TCR repertoire diversity indexes between tumor and adjacent normal tissues

2.3 不同臨床特征腫瘤患者的TCR組庫(kù)多樣性分析

發(fā)生于直腸的CRC 患者TCR 克隆型的數(shù)目高于非直腸位部（P=0.040，圖5A），提示直腸部位腫瘤TCR 組庫(kù)多樣性更高。Fn 高負(fù)荷CRC 腫瘤組織的克隆型的數(shù)目（P=0.040，圖5B）和Chao1 指數(shù)（P=0.030，表1）低于Fn 低負(fù)荷CRC 腫瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示不同F(xiàn)n 豐度下CRC 腫瘤組織的TCR 組庫(kù)多樣性具有差異，F(xiàn)n 豐度越高的腫瘤組織TCR 組庫(kù)多樣性越低。而不同年齡、性別（≥65 歲vs＜65 歲）、TNM 分期（Ⅰ/Ⅱ期vsⅢ/Ⅳ期）的CRC患者，腫瘤組織Chao1指數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 不同臨床特征和不同F(xiàn)n豐度下Chao1指數(shù)比較Tab 1 Comparison of Chao1 indexes in different clinical features and different Fn loads

圖5 不同腫瘤部位以及不同F(xiàn)n豐度下TCR克隆型比較Fig 5 Comparison of TCR clonotypes in different tumor locations and different Fn loads

3 討論

近年來(lái)，不少實(shí)體腫瘤的研究試圖深入挖掘免疫組庫(kù)信息，從而為疾病的診斷、免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)和患者預(yù)后評(píng)估提供新型生物學(xué)標(biāo)志物［16-18］。然而關(guān)于TCR 組庫(kù)在CRC 中的相關(guān)研究開(kāi)展得較少。SHERWOOD 等［19］通過(guò)對(duì)比分析15 例CRC 患者的TCR β 鏈測(cè)序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)性T 細(xì)胞的多樣性變異遠(yuǎn)低于癌周正常黏膜組織，同時(shí)腫瘤組織中TCR 組庫(kù)的寡克隆性較高，提示腫瘤組織和周圍正常黏膜組織內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)不同。既往關(guān)于TCR組庫(kù)多樣性的研究大多依靠TCR-seq技術(shù)獲得樣本的TCR 序列。盡管測(cè)序技術(shù)能夠較為準(zhǔn)確地呈現(xiàn)TCR序列特征，但測(cè)序費(fèi)用高昂，且既往研究納入的樣本量都比較少。本研究使用TRUST 算法挖掘CRC 腫瘤組織和其匹配的癌周正常黏膜組織RNA-seq數(shù)據(jù)中的免疫組庫(kù)信息，相比于單獨(dú)針對(duì)樣本進(jìn)行TCR-seq處理，經(jīng)濟(jì)成本有所降低，數(shù)據(jù)處理更加高效，并能獲取機(jī)體更多的生物學(xué)信息。此外，基于既往研究［3］發(fā)現(xiàn)的Fn 在CRC 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程的重要作用，我們?cè)噲D尋找CRC 組織中的TCR 組庫(kù)多樣性與Fn 豐度之間的關(guān)系。

本研究對(duì)比分析53 例CRC 患者的腫瘤組織及其匹配的癌周正常黏膜組織的TCR 組庫(kù)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中擴(kuò)增水平前10 位克隆型的占比顯著高于癌周正常黏膜組織，這提示腫瘤狀態(tài)下T細(xì)胞受到外界抗原刺激，可能存在單克隆或寡克隆反應(yīng)性增生，導(dǎo)致TCR 某一序列克隆比例顯著上升，而多樣性卻呈現(xiàn)總體下降趨勢(shì)。腫瘤組織和癌周正常組織間TCR 組庫(kù)多樣性的差異，對(duì)于研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制具有重要的參考價(jià)值。CRC 中發(fā)生于直腸部位的腫瘤通常表現(xiàn)出對(duì)治療的高敏感性以及更好的預(yù)后［1］。本研究中，發(fā)生于直腸部位的腫瘤的TCR 組庫(kù)多樣性較非直腸部位腫瘤更高，這提示TCR 組庫(kù)可能有助于CRC 的臨床治療和預(yù)后評(píng)估。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CRC 腫瘤組織內(nèi)的Fn 豐度與TCR 組庫(kù)多樣性有關(guān)，在較低的Fn 負(fù)荷下，腫瘤的TCR 組庫(kù)多樣性更高。Fn 與CRC 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤組織內(nèi)Fn 的高負(fù)荷與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［2］。TCR 組庫(kù)多樣性特點(diǎn)與CRC 患者的Fn 豐度相關(guān)，進(jìn)一步提示TCR 組庫(kù)多樣性能夠作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于CRC發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的研究中。

本研究尚存在一定的局限性。TCR β 鏈的CDR3序列信息是通過(guò)TRUST 算法計(jì)算得出的，盡管該算法十分高效，但難以避免存在一定的誤差。這需要未來(lái)開(kāi)發(fā)更多更高效的檢測(cè)手段或者計(jì)算方法來(lái)盡可能地還原生物原始的CDR3序列信息。同時(shí)，TCR 組庫(kù)多樣性在CRC 的臨床診治及預(yù)后評(píng)估過(guò)程中的相關(guān)價(jià)值也有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。在CRC 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，TCR 組庫(kù)多樣性發(fā)生改變機(jī)制如何，是否存在疾病特征性的TCR 單克隆序列，TCR組庫(kù)多樣性特點(diǎn)是否可以用于直接評(píng)估CRC 患者的預(yù)后和免疫治療效果，都有待于進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究利用TRUST 算法從53 例CRC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)中挖掘患者的免疫組庫(kù)信息，發(fā)現(xiàn)TCR 組庫(kù)多樣性與患者多項(xiàng)臨床特征以及腫瘤組織內(nèi)的Fn 豐度有關(guān)，為CRC 發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制研究提供了重要信息。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院科學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（2016-01-15）。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（2016-01-15）. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

陳豪燕、洪潔參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；胡慕妮完成主要統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖；季林華、張昕雨和沈超琴主要負(fù)責(zé)標(biāo)本收集和實(shí)驗(yàn)部分；胡慕妮、陳豪燕參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

CHEN Haoyan and HONG Jie were responsible for the experimental design. HU Muni completed the main statistical analysis and mapping.JI Linhua，ZHANG Xinyu and SHEN Chaoqin mainly prepared for specimen collection and experiments.CHEN Haoyan and HU Muni participated in the writing and revision of the paper. All authors have read and approved the submission of the final manuscript.

·Received：2022-01-24

·Accepted：2022-05-27

·Published online：2022-07-25

參·考·文·獻(xiàn)

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