宗春燕，何 杰，張 哲，賈仁兵，沈鍵鋒

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海200011

載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化亞基3（apolipoprotein B mRNA editing catalytic subunit 3，APOBEC3） 蛋白家族擁有7 個成員，主要包括APOBEC3A （A3A） 、 APOBEC3B （A3B） 、APOBEC3C （A3C） 、 APOBEC3D （A3D） 、APOBEC3F （A3F） 、 APOBEC3G （A3G） 和APOBEC3H（A3H）［1］，主要功能為催化單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）上的胞嘧啶脫氨形成尿嘧啶，引起突變。APOBEC 相關(guān)的突變可見于多種腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌和頭頸癌等［2-3］。

研究［4-5］表明，APOBEC3B 在多種類型腫瘤的組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，可能是多種腫瘤的主要誘變劑。APOBEC3B 會導(dǎo)致廣泛的C→T 誘變和基因組尿嘧啶水平的升高，從而導(dǎo)致基因組尿嘧啶損傷［6-7］，其所引起的突變特征在乳腺癌、宮頸癌、肺癌（包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌）、頭頸癌和膀胱癌中都有所表現(xiàn)［1-2］。APOBEC3B 這種誘變模式可能對癌變過程中體細(xì)胞突變起重要作用，并最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定［2］。一方面，APOBEC3B 的DNA 誘變能力可促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，與其相關(guān)的突變可促進(jìn)腫瘤亞克隆多樣性，增強腫瘤耐藥性［8］。另一方面，APOBEC3B 誘變導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定為細(xì)胞毒性和免疫療法提供了重要機會［9-10］。APOBEC3B 高表達(dá)與乳腺癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤的不良預(yù)后（包括耐藥性）相關(guān)［11-14］。APOBEC3B 高表達(dá)使透明細(xì)胞卵巢癌對一些基因毒性藥物（如順鉑）治療敏感［15］。APOBEC3B 所誘發(fā)的基因組不穩(wěn)定甚至可能與常規(guī)化學(xué)治療（化療）藥物（如鉑類）造成的DNA 損傷一起形成新的合成致死組合，使腫瘤細(xì)胞對APOBEC3B損傷更敏感。

眼部黑色素瘤主要包括葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM） 和結(jié)膜黑色素瘤（conjunctival melanoma，CM），是罕見的黑色素瘤類型，約占所有黑色素瘤病例的5%，但在眼部惡性腫瘤中比例較高［16-17］。其中，UM 是成人最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，具有高度侵襲性，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，死亡率極高［18］。目前針對UM 靶向治療的研究有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能改善UM 患者預(yù)后不良的現(xiàn)狀。本研究擬探索APOBEC3B 在UM 中的關(guān)鍵作用通路，確定其作用的關(guān)鍵下游基因，以期尋找UM治療新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國），電泳裝置（Bio-Rad，美國），離心機（Eppendorf，德國），Odyssey紅外成像系統(tǒng)（LI-COR，美國），數(shù)字切片掃描儀（3DHIESTECH，匈牙利），HP Scanjet 5590 掃 描 儀（HP，美 國），LightCycler?480 Ⅱ（Roche，瑞士），激光掃共聚焦顯微鏡（Leica，德國）。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素（Gibco，美國），蛋白裂解液RIPA、氨芐青霉素鈉、結(jié)晶紫染色液、蛋白酶抑制劑（Sangon Biotech，中國），DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Vazyme，中國）、PolyJet 轉(zhuǎn)染試劑（SignaGen，美國），Trizol（Invitrogen，美國），限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、BsmBⅠ（NEB，美國）、T4 連接酶（Vazyme，中國）、APOBEC3B 抗體（ab184990，Abcam，英國），β-actin 抗體（66009，Proteintech，美國），磷酸化復(fù)制蛋白A 32 kDa 亞基（replication protein A 32 kDa subunit，RPA32）抗體（Ser4/Ser8）（A300-245A-M，Bethyl，美國），熒光二抗（A21206，Invitrogen，美國），ProLong?Diamond 抗淬滅封片劑（Invitrogen，美國），細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime，中國），細(xì)胞周期檢測點激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1， CHK1） 抑 制 劑 Rabusertib （S2626，Selleck，美國），Applied Biosystems?SYBR?Green預(yù)混液（Thermo Fisher Scientific，美國），硫酸羥脲（hydroxyurea，HU）（Selleck，美國）。

1.1.3 細(xì)胞和質(zhì)粒 本研究所使用細(xì)胞系包括UM細(xì) 胞 系 （92-1、 OMM1、 OMM2.3、 MEL202、MEL270、MEL285、MEL290、MUM2B 和OCM1）、CM 細(xì)胞系（CRMM1、CRMM2 和CM2005.1）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）細(xì)胞系（A375、A2058）、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞，以及人腎上皮細(xì)胞293。UM 細(xì) 胞 系OMM1、OMM2.3、MEL285 和MEL290 由Martine J. Jager 教授（荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心）饋贈，293 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，其余細(xì)胞系均為上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室?guī)齑?。?jīng)鑒定，細(xì)胞系均無支原體污染。所有UM 細(xì)胞、CM 細(xì)胞和RPE 細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，A375、A2058和293 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 °C 含5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。載體質(zhì)粒pGIPZ、lentiCRISPRv2 以及病毒包裝質(zhì)粒PMD2.G、PSPAX2均為上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室?guī)齑妗?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 眼黑色素瘤患者組織和色素痣組織均來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。組織載玻片通過乙醇進(jìn)行一系列的脫蠟和再水化，然后用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。腫瘤切片用含有0.1% Triton X-100 和3% H2O2的5%正常山羊血清在室溫下封閉1 h，然后在4 ℃下與APOBEC3B 抗體（1∶100）孵育過夜。免疫組織化學(xué)（immunochemistry，IHC）染色完成后使用數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行掃描，使用CaseViewer 軟件可視化觀察掃描圖片。

1.2.2 Western blotting 收獲細(xì)胞并用PBS 沖洗3次，用蛋白裂解液RIPA于冰上裂解蛋白，并在4 ℃下離心收集蛋白質(zhì)上清液。蛋白質(zhì)樣品定量后取20 μg 總蛋白上樣至SDS-PAGE 電泳凝膠跑膠，待蛋白條帶分離，完成電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。在室溫下用5%牛奶封閉1 h 后，將膜與相應(yīng)濃度的一抗在4 ℃下孵育過夜。第二日用TBST 溶液洗去多余的一抗后，將膜與熒光二抗于室溫下共同孵育1 h。在使用TBST 溶液洗去多余的二抗后使用Odyssey 紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行顯像。使用Image J 軟件對Western blotting條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建 ①APOBEC3B-shRNA 質(zhì)粒構(gòu) 建 。 靶 向APOBEC3B的 外 顯 子 序 列（TTAAAGTTGAAAGTGAATGTGG） 設(shè) 計 合 成shRNA 編碼序列，經(jīng)退火后與載體質(zhì)粒pGIPZ 一起使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ按照說明書進(jìn)行酶切，酶切后使用T4 連接酶進(jìn)行重組，經(jīng)測序正確后使用。APOBEC3B-shRNA 質(zhì)粒用于后續(xù)APOBEC3B敲低細(xì)胞系shAPOBEC3B構(gòu)建，空載質(zhì)粒用于對照細(xì)胞系shCtrl構(gòu)建。②CRISPR-Cas9質(zhì)粒APOBEC3BsgRNA 構(gòu) 建。 靶 向APOBEC3B的 外 顯 子 序 列（AAATCTCCTTTGGGACACAG） 設(shè)計合成sgRNA編碼序列。使用BsmBⅠ核酸內(nèi)切酶按照說明書對載體質(zhì)粒lentiCRISPRv2 進(jìn)行酶切，使用T4 連接酶將退火后的sgRNA 序列重組于lentiCRISPRv2 載體質(zhì)粒中測序鑒定，測序結(jié)果證實插入片斷與設(shè)計序列完全一致后使用。APOBEC3B-sgRNA 用于后續(xù)APOBEC3B敲除細(xì)胞系sgAPOBEC3B構(gòu)建，空載質(zhì)粒用于對照細(xì)胞系Vector 構(gòu)建。③慢病毒包裝。使用293 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，待細(xì)胞密度到達(dá)70%以上（10 cm皿）時進(jìn)行。將60 μL PolyJet 轉(zhuǎn)染試劑加入無血清DMEM 中配制500 μL PolyJet混懸液。配制含有目的質(zhì)粒（5 μg）、PMD2.G（5 μg）和PSPAX2（10 μg）的質(zhì)?；鞈乙?。室溫靜置5 min 后，將PolyJet混懸液加入質(zhì)?；鞈乙褐?，室溫靜置15 min后滴加至293細(xì)胞上清液中。培養(yǎng)6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h 后收集病毒液，病毒經(jīng)0.22 μm 濾頭過濾后用于細(xì)胞感染。④靶細(xì)胞感染與篩選。將準(zhǔn)備感染病毒的細(xì)胞以30%的密度接種至培養(yǎng)皿中，待其貼壁后開始病毒感染。更換新鮮培養(yǎng)基后以1∶1 的體積比例將病毒液緩慢滴加至培養(yǎng)基中，并以1∶1 000的比例加入聚凝胺（polybrene）。感染病毒48 h 后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，并使用相應(yīng)的抗生素如嘌呤霉素（puromycin）進(jìn)行篩選，使用嘌呤霉素篩選OMM2.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系時使用的濃度為2 μg/mL。篩選1周后使用Western blotting驗證APOBEC3B敲低或敲除效率。另外，對APOBEC3B敲除的細(xì)胞系進(jìn)行單克隆挑選，挑選出的單克隆細(xì)胞株分別通過Western blotting分析和基因組DNA 測序驗證APOBEC3B敲除情況以及基因編輯情況以挑選出成功敲除APOBEC3B的單克隆細(xì)胞株。

1.2.4 克隆形成實驗 將OMM2.3 sgAPOBEC3B和Vector 細(xì)胞按相應(yīng)的密度接種至6 孔板，每組樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)2～3周，每隔3 d換液。藥物敏感性實驗使用OMM2.3 shAPOBEC3B和shCtrl 細(xì)胞進(jìn)行，使用CHK1 抑制劑Rabusertib 處理細(xì)胞，每隔3 d 進(jìn)行加藥處理。待長出肉眼可見的克隆后棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗后加入通用型組織固定液（4%PFA）固定15 min。棄去固定液后加入結(jié)晶紫染液常溫染色20 min，用清水洗凈后自然晾干，然后用HP Scanjet 5590 掃描儀進(jìn)行掃描成像。使用Image J 軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 收集2×105個shAPOBEC3B及對照shCtrl OMM2.3 細(xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞1 次后使用70%乙醇固定細(xì)胞，于4 ℃冰箱固定過夜。固定完成后用冰PBS 清洗，參照試劑盒說明書比例加入核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）以及碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色30 min，流式細(xì)胞儀上機分析，得到原始數(shù)據(jù)后使用Flowjo 軟件分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序 本研究中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序（RNA sequencing，RNA-seq）由北京諾禾致源生物科技公司完成。每組共設(shè)置2 個生物學(xué)重復(fù)。使用Trizol 法從細(xì)胞中提取APOBEC3B敲低和對照OMM2.3 細(xì)胞總RNA，通過Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統(tǒng)檢測RNA 完整性和總量，每個樣品約需要1 μg 的總RNA。在轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建完成并質(zhì)檢合格后上機測序，對各組樣本進(jìn)行基因表達(dá)水平定量。直接從基因組網(wǎng)站下載參考基因組文件（http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz）和基因模型注釋文件（https：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.primary_assembly.annotation.gtf.gz），計算每個基因的每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）值。對差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），使用基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、Reactome、人類疾病分類（disease ontology，DO）、基因本體分析生物過程（gene ontology biological process，GOBP） 數(shù)據(jù)集，將基因按照在2 類樣本中的差異表達(dá)程度排序，檢測基因集合的表達(dá)變化。使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制差異基因表達(dá)熱圖。

1.2.7 實時熒光定量PCR 使用Applied Biosystems?SYBR?Green 預(yù)混液配制10 μL PCR 反應(yīng)體系，使用LightCycler?480 Ⅱ儀器進(jìn)行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），使用配套軟件進(jìn)行CT值計算和可視化分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對照計算RNA 的表達(dá)量。用于qRTPCR的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 檢測相關(guān)基因的引物序列Tab 1 Genes and primer sequences used for qRT-PCR analysis

1.2.8 免疫熒光染色 將不同處理組的OMM2.3細(xì)胞接種于爬片上，待貼壁完全后進(jìn)行染色。HU 處理組使用2 mmol/L HU處理細(xì)胞4 h后進(jìn)行染色。用PBS清洗細(xì)胞爬片后，用4%甲醛溶液固定爬片15 min，PBS清洗1 次，接著使用0.3%的Triton X-100 溶液對細(xì)胞進(jìn)行通透。用5%BSA 溶液封閉爬片，待封閉完成后用100 μL 磷 酸 化RPA32 （phosphorylated RPA32，p-RPA32）抗體（1∶200 稀釋）4 ℃孵育過夜。PBS洗3 次后加入熒光二抗，常溫孵育1 h，PBS 洗3 次。在載玻片上滴1 滴含DAPI 的抗淬滅封片劑，然后將玻片蓋在載玻片上。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍攝照片，DAPI 核染色顯示為藍(lán)色，p-RPA32 顯示為綠色。

1.2.9 數(shù)據(jù)庫分析 使用GEPIA 網(wǎng)站（http：//gepia.cancer-pku.cn）完成對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中UM 患者的預(yù)后分析及各類腫瘤中APOBEC3B基因表達(dá)情況分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料采用表示。使用非配對t檢驗比較2組之間的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的表達(dá)情況以及對患者生存的影響

為檢測APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的表達(dá)情況，對眼部黑色素瘤組織進(jìn)行了IHC 染色（圖1A）。使用APOBEC3B 抗體對福爾馬林固定石蠟包埋的良性痣組織和眼部黑色素瘤組織進(jìn)行染色。首先，染色結(jié)果顯示著色部位大多在細(xì)胞核內(nèi)，這與APOBEC3 B 定位于核內(nèi)相符合［19］。另外，良性色素痣組織中APOBEC3B 著色很弱，而在眼部黑色素瘤組織中，每個腫瘤組織切片的大部分細(xì)胞核中均可檢測到強免疫陽性，說明相對于良性色素痣，眼部黑色素瘤組織中APOBEC3B表達(dá)水平更高。

另外，通過GEPIA網(wǎng)站對TCGA數(shù)據(jù)庫中UM患者總生存時間以及無病生存時間的分析發(fā)現(xiàn)，APOBEC3B高表達(dá)與UM 患者總生存期縮短相關(guān)（P=0.032，圖1B），且與UM 患者的無病生存期顯著縮短相關(guān)（P=0.000，圖1C）。對TCGA 數(shù)據(jù)庫中腫瘤患者APOBEC3B基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明APOBEC3B在大多數(shù)的腫瘤組織中高表達(dá)（圖1D）。

圖1 APOBEC3B在腫瘤中的表達(dá)情況以及對UM患者生存的影響Fig 1 Expression of APOBEC3B in tumors and its effect on UM patient survival

2.2 APOBEC3B 敲低和敲除的OMM2.3細(xì)胞系的建立

以RPE細(xì)胞作為對照，應(yīng)用Western blotting檢測UM 細(xì) 胞 （92-1、 OMM1、 OMM2.3、 MEL202、MEL270、MEL285、MEL290、MUM2B 和OCM1）、CM 細(xì) 胞（CRMM1、 CRMM2 和CM2005.1） 和SKCM 細(xì)胞（A375 和A2058）總蛋白表達(dá)水平（圖2A）。相較于RPE 細(xì)胞，大多數(shù)黑色素瘤的細(xì)胞系，尤 其 是UM 細(xì) 胞 系OMM2.3、 92-1、 MEL202、OMM1、MUM2B 中APOBEC3B 蛋白表達(dá)均顯著升高。

為探索APOBEC3B 對UM 的作用機制，選取高表達(dá)APOBEC3B 蛋白的UM 細(xì)胞系OMM2.3 進(jìn)行研究，并建立了APOBEC3B敲低和敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。首先構(gòu)建了APOBEC3B敲低的慢病毒質(zhì)粒（shAPOBEC3B）和對照質(zhì)粒（shCtrl），并將其分別轉(zhuǎn)染至OMM2.3 細(xì)胞中，構(gòu)建APOBEC3B敲低的OMM2.3 細(xì)胞系和對照細(xì)胞系；Western blotting 驗證APOBEC3B 蛋白的敲低效率約為63.9%（圖2B）。然后，通過CRISPR-Case9 技術(shù)，靶向APOBEC3B基因序列設(shè)計APOBEC3B敲除的APOBEC3B-sgRNA 慢病毒質(zhì)粒。然后將構(gòu)建好的APOBEC3B敲除質(zhì)粒sgAPOBEC3B和對照質(zhì)粒Vector包裝成慢病毒，分別感染OMM2.3 細(xì)胞；經(jīng)單克隆細(xì)胞株挑選后，使用Western blotting、基因組DNA 測序驗證成功敲除APOBEC3B的單克隆細(xì)胞株（圖2C、D）。結(jié)果顯示，與對照未敲除APOBEC3B的OMM2.3 細(xì)胞相比，成功敲除APOBEC3B的細(xì)胞無對應(yīng)蛋白表達(dá)條帶，且在靶向序列附近檢測到基因編輯。

圖2 APOBEC3B在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況和APOBEC3B敲低和敲除細(xì)胞系的構(gòu)建Fig 2 Expression of APOBEC3B in tumor cells and construction of APOBEC3B knockdown and knockout cell lines

2.3 APOBEC3B的表達(dá)對OMM2.3的克隆形成能力和細(xì)胞周期的影響

為研究APOBEC3B 表達(dá)對OMM2.3 細(xì)胞的影響，對sgAPOBEC3B和Vector OMM2.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行克隆形成實驗。在孔板中接種等量細(xì)胞數(shù)的sgAPOBEC 3B和Vector 細(xì)胞，待形成肉眼可見的克隆后進(jìn)行染色，掃描成像（圖3A）。結(jié)果表明，與對照未敲除APOBEC3B的OMM2.3 細(xì) 胞 相 比，APOBEC3B敲 除的細(xì)胞并未表現(xiàn)出克隆形成數(shù)量的顯著改變（P＞0.05，圖3B）。

另外，通過使用流式細(xì)胞術(shù)，對shAPOBEC3B和shCtrl OMM2.3 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測（圖3C）。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，APOBEC3B敲低并未導(dǎo)致細(xì)胞周期的顯著改變（圖3D）。這些結(jié)果表明，APOBEC3B在OMM2.3中的表達(dá)并不影響細(xì)胞的克隆形成和細(xì)胞周期。

圖3 APOBEC3B的表達(dá)對OMM2.3細(xì)胞的克隆形成能力和細(xì)胞周期的調(diào)控Fig 3 Clonogenic ability and cell cycle regulation of OMM2.3 cells by APOBEC3B expression

2.4 APOBEC3B對OMM2.3細(xì)胞復(fù)制應(yīng)激相關(guān)通路的調(diào)控

為進(jìn)一步探索APOBEC3B 在OMM2.3 細(xì)胞中的功能，識別APOBEC3B 下游效應(yīng)子，對建立好的shAPOBEC3B細(xì)胞和對照shCtrl 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq。經(jīng)檢測，shAPOBEC3B細(xì)胞和對照shCtrl 細(xì)胞中存在223個差異表達(dá)的基因，其中49個基因在APOBEC3B敲低后表達(dá)上調(diào)，174 個基因表達(dá)下調(diào)（圖4A）。為研究這些基因的作用通路，通過GSEA 對這些差異基因進(jìn)行了富集分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因富集到了一些DNA 復(fù)制通路（圖4B）。對shAPOBEC3B細(xì)胞和對照shCtrl 細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果也表明，APOBEC3B敲低影響了一些復(fù)制應(yīng)激相關(guān)通路基因，如增殖細(xì)胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等表達(dá)的改變（圖4C）。同時，通過RT-qPCR對差異基因進(jìn)行檢測，驗證了細(xì)胞周期蛋白H（cyclin H，CCNH）、黑色素瘤抗應(yīng)激通路的介質(zhì)多巴色素互變異構(gòu)酶（dopachrome tautomerase，DCT）等下游基因表達(dá)改變（圖4D）。因此推測，APOBEC3B 可能在DNA 復(fù)制過程中通過其催化突變的作用，參與OMM2.3細(xì)胞的復(fù)制應(yīng)激過程，從而有可能使其對復(fù)制應(yīng)激通路的靶向藥物敏感。

在shAPOBEC3B細(xì)胞和對照shCtrl 細(xì)胞中，對復(fù)制應(yīng)激通路關(guān)鍵靶標(biāo)p-RPA32進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果表明APOBEC3B敲低后p-RPA32 熒光強度明顯降低，并且在HU 誘導(dǎo)復(fù)制叉停滯、復(fù)制應(yīng)激通路被激活時，這種現(xiàn)象更為明顯（圖4E）。為研究APOBEC3B 的表達(dá)是否會影響OMM2.3 細(xì)胞對復(fù)制應(yīng)激通路靶向藥物的敏感性，挑選CHK1 抑制劑對shAPOBEC3B和對照shCtrl OMM2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性研究。將相同數(shù)量的APOBEC3B敲低及對照OMM2.3細(xì)胞系接種于孔板中，待細(xì)胞貼壁后對細(xì)胞進(jìn)行CHK1 抑制劑藥物處理，并設(shè)置不加藥的DMSO組對照，待形成肉眼可見的細(xì)胞克隆后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并掃描成像（圖4F）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，在1.25 μmol/L 的CHK1 抑制劑處理下，對照組的克隆形成明顯減少（圖4G）。而APOBEC3B敲低組的克隆形成數(shù)量雖然也有所減少，但是相較于對照組，克隆數(shù)量減少程度相對微弱。這表明與敲低APOBEC3B的OMM2.3 細(xì) 胞 相 比，APOBEC3B正 常表達(dá)的OMM2.3 細(xì)胞對CHK1 抑制劑的處理更為敏感。對照細(xì)胞系克隆形成數(shù)的減少程度明顯大于APOBEC3B敲低組，證明APOBEC3B 表達(dá)使得OMM2.3細(xì)胞對CHK1抑制劑更為敏感。

圖4 OMM2.3細(xì)胞中APOBEC3B對復(fù)制應(yīng)激相關(guān)通路的調(diào)控Fig 4 Regulation of replication stress-related pathways by APOBEC3B in OMM2.3 cells

3 討論

由于腫瘤異質(zhì)性，APOBEC3B 在不同的腫瘤中發(fā)揮不同作用。在乳腺癌中，APOBEC3B 高表達(dá)腫瘤的突變數(shù)量是低表達(dá)腫瘤的2 倍；內(nèi)源性APOBEC3B 蛋白是乳腺癌細(xì)胞系提取物中唯一可檢測到的具有將DNA 胞嘧啶突變至尿嘧啶的堿基編輯活性物質(zhì)的來源［5］。研究［11，20］表明，APOBEC3B 是雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，且APOBEC3B 誘導(dǎo)的基因異常促進(jìn)了乳腺癌進(jìn)展。APOBEC3B 在透明細(xì)胞卵巢癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與預(yù)后改善相關(guān)［15］。APOBEC3B 表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生的基因毒性作用更為敏感，因此APOBEC3B 可作為預(yù)測鉑類化療反應(yīng)敏感性的候選生物學(xué)標(biāo)志物。APOBEC3B 是胃癌預(yù)后獨立危險因素，APOBEC3B 調(diào)控胃癌的腫瘤微環(huán)境，使表達(dá)效應(yīng)分子和免疫檢查點分子的腫瘤反應(yīng)性CD8+T 細(xì)胞浸潤減少［21］。另外，APOBEC3B還通過誘導(dǎo)S 期阻滯，調(diào)控腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞增殖［22］。而APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的作用尚未見文獻(xiàn)報道。

在本研究中，對TCGA 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示APOBEC3B在UM 患者中高表達(dá)，且顯著影響患者總生存期和無病生存期。在眼部黑色素瘤患者的組織樣本以及細(xì)胞系中也分別驗證了APOBEC3B 的高表達(dá)，因此推測APOBEC3B 在眼部黑色素發(fā)生發(fā)展中可能存在著重要功能。文獻(xiàn)［23］報道APOBEC3B 在G2/M期顯著高表達(dá)，可能參與調(diào)控細(xì)胞周期，然而敲除APOBEC3B并未導(dǎo)致OMM2.3 克隆形成能力和細(xì)胞周期的顯著改變。APOBEC3B敲低和對照的OMM2.3細(xì)胞的RNA-seq 結(jié)果顯示APOBEC3B敲低后的差異表達(dá)基因并不多，提示APOBEC3B 在UM 中作用機制可能處于相對下游的位置。進(jìn)一步通過GSEA 分析差異基因發(fā)現(xiàn)，在OMM2.3 細(xì)胞中，APOBEC3B 參與調(diào)控DNA 復(fù)制通路。鑒于APOBEC3B 促進(jìn)腫瘤突變負(fù)荷增加的功能［24］，以及APOBEC3B 在乳腺癌中參與復(fù)制應(yīng)激通路作用的相關(guān)報道［25］，APOBEC3B可能與OMM2.3 細(xì)胞的復(fù)制應(yīng)激過程相關(guān)。DNA 復(fù)制應(yīng)激是腫瘤基因組不穩(wěn)定性的主要來源［26］。APOBEC3B 可通過在DNA 復(fù)制叉處誘導(dǎo)無堿基位點，施加復(fù)制壓力［27］。在APOBEC3B敲低的OMM2.3 細(xì)胞中檢測到復(fù)制應(yīng)激通路關(guān)鍵靶標(biāo)p-RPA32水平的降低。在復(fù)制應(yīng)激通路激活后，RPA32會被活化的共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張Rad3 相關(guān)蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related protein，ATR）和DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）磷酸化，從而進(jìn)一步導(dǎo)致CHK1激活和復(fù)制停滯［28］。因此，APOBEC3B 的表達(dá)可能會使細(xì)胞對一些靶向復(fù)制應(yīng)激的藥物敏感，可能作為UM治療的靶標(biāo)。

在本研究中，使用復(fù)制應(yīng)激通路靶向藥物CHK1抑制劑對APOBEC3B敲低和對照OMM2.3 細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APOBEC3B 表達(dá)的OMM2.3 細(xì)胞對CHK1 抑制劑更敏感， 可見APOBEC3B有潛力作為UM 對CHK1抑制劑治療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，也有研究者認(rèn)為APOBEC3B 活性只是影響復(fù)制應(yīng)激通路靶向藥物敏感性的一部分因素［27］，其他因素如共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）、p53基因丟失等也可能增加藥物敏感性［29-31］。APOBEC3B 表達(dá)活性是否可以用于預(yù)測CHK1 靶向治療敏感性，以及是否需要結(jié)合其他因素預(yù)測治療敏感性，仍需要進(jìn)一步研究。

總之，APOBEC3B參與OMM2.3細(xì)胞復(fù)制應(yīng)激相關(guān)通路，有潛力作為評價CHK1抑制劑治療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物，為靶向治療UM提供新的選擇。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)（文件號SH9H-2019-T185-2）。所有實驗過程均遵照《世界醫(yī)學(xué)大會赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Ethics Committee of Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （approval letter No. SH9H-2019-T185-2），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of theWorld Medical Association Declaration of Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

宗春燕、何杰參與了生物學(xué)實驗；張哲參與了數(shù)據(jù)分析；沈鍵鋒參與了實驗設(shè)計；宗春燕、賈仁兵、沈鍵鋒參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The biological experiment was completed by ZONG Chunyan and HE Jie. Data were analyzed by ZHANG Zhe. The study was designed by SHEN Jianfeng.The manuscript was drafted and revised by ZONG Chunyan，JIA Renbing and SHEN Jianfeng. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-15

·Accepted：2022-06-25

·Published online：2022-07-25

參·考·文·獻(xiàn)

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