鄒菁華，宮淼淼，沈 瑛

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系，上海200025；2.上海市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200025

肺癌的發(fā)病率和病死率都高居惡性腫瘤前列，預(yù)計(jì)5 年生存率僅為18%，嚴(yán)重威脅著人類生命健康［1］。在疾病進(jìn)展過程中，肺癌原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞會(huì)通過局部浸潤以及血管和淋巴管的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移而定植到其他部位生長，稱為腫瘤轉(zhuǎn)移［2］。轉(zhuǎn)移不僅是腫瘤耐藥復(fù)發(fā)的主要原因，更是患者常見的死因［3-4］。

大鼠肉瘤病毒（rat sarcoma，Ras）家族是腫瘤中突變頻率最高的基因家族［5］，其中鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，Kras）的惡性程度最高，是肺癌（30%）、結(jié)腸癌（40%）、胰腺癌（80%） 三大致命癌癥的主要致癌驅(qū)動(dòng)基因［6］。人類約13%的惡性腫瘤伴隨KRAS基因突變［7］，肺癌中KRAS主要突變亞型包括KRASG12C、KRASG12D、KRASG12V、KRASQ61H等，其 中KRASG12C占比高達(dá)46%［8］。然而，由于KRAS 與鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）的高親和力以及表面缺少可以與小分子緊密結(jié)合的疏水口袋，KRAS 一度被認(rèn)為是不可成藥的靶點(diǎn)［8-10］。 近年來，KRASG12C共價(jià)抑制劑AMG510 和MRTX849 成功研發(fā)，臨床試驗(yàn)療效顯著，給KRASG12C突變患者帶來新的希望，然而長期使用均不可避免發(fā)生適應(yīng)性或獲得性耐藥［11］。

KRAS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的過程中，其第四外顯子發(fā)生選擇性剪切，得到KRAS4A 和KRAS4B 這2 種剪接形式的蛋白，這2 種蛋白在保守結(jié)構(gòu)域（1-165殘基） 具有高度同源性，其中包括鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）/GTP 結(jié)合區(qū)和效應(yīng)因 子 結(jié) 合 區(qū)［12-13］， 在 C 端 高 度 可 變 區(qū)（hypervariable region，HVR，166-188 或189 殘基）存在差異，這一區(qū)域在膜靶向性、蛋白-蛋白相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用［14］。KRAS4A和KRAS4B在人類胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平相當(dāng)，而在成體組織中差異表達(dá)［15］，且均能編碼致癌蛋白［16］。在腫瘤細(xì)胞中，KRAS通常在第一或第二外顯子的12、13、61 密碼子發(fā)生點(diǎn)突變，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，從而處于異常激活狀態(tài)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展［17-19］。有研究報(bào)道，KRAS4A 具有獨(dú)特的雙膜靶向結(jié)構(gòu)，能夠特異性結(jié)合并激活己糖激酶1（hexokinase 1，HK1）［20］，而KRAS4B 通過C 端高度可變區(qū)與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM） 結(jié)合，有利于保持腫瘤細(xì)胞的干性狀態(tài)［21］。在肺癌細(xì)胞系中，KRAS4BmRNA 水平顯著高于KRAS4AmRNA［16］。然而，關(guān)于KRAS4A 和KRAS4B 在肺癌轉(zhuǎn)化過程中的生物學(xué)差異尚未研究清楚。本研究將圍繞KRAS4A 和KRAS4B 促進(jìn)人肺支氣管上皮細(xì)胞生長和運(yùn)動(dòng)的差異與分子機(jī)制進(jìn)行深入探究，構(gòu)建人正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)細(xì)胞株，通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞表型差異，全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq 方法檢測(cè)差異基因及信號(hào)通路變化并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR）進(jìn)一步驗(yàn)證，通過探究不同剪接體致癌機(jī)制的差異，為KRAS 特異性靶向抑制劑的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 細(xì)胞系 人正常肺支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B，人胚腎上皮永生化細(xì)胞系293FT 均在上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系保存并使用。

1.1.2 主要試劑 0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素-鏈霉素（雙抗）溶液及谷氨酰胺溶液購自上海源培生物科技股份有限公司，Takara RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix （Perfect Real Time）試劑盒購自日本Takara 公司，轉(zhuǎn)染專用減血清培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、BCA 蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白分子量marker、Lipofectamine 3000 試劑、P3000試劑及ECL 顯色液購自美國Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清購自美國Gemini 公司，Ku86 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，Tubulin 抗體購自美國Proteintech 公司，RAS 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 及抗小鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology 公司，RIPA 裂解液、Western blotting 一抗稀釋液及蛋白酶抑制劑購自上海碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，制冰機(jī)購自美國Scotsman 公司，蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、預(yù)制膠、多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司，實(shí)驗(yàn)用超純水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司，Incucyte 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)成像儀購自美國Essen 公司，Odyssey 雙色紅外成像系統(tǒng)購自美國LI-COR 公司，倒置相差顯微鏡購自日本Nikon 公司，磁力攪拌器購自德國IKA 公司，移液器、低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 配制DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含1%谷氨酰胺、1%雙抗溶液、10%胎牛血清）。PBS 清洗細(xì)胞，37 ℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶（含0.038% EDTA）消化1～2 min，新鮮完全培養(yǎng)基終止消化。1∶3 傳代，持續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.2 構(gòu)建過表達(dá)KRAS4AG12C和KRAS4BG12C細(xì)胞系 按比例配制轉(zhuǎn)染專用減血清培養(yǎng)基、Lipo 3000試劑、P3000 Enhancer Reagent、包裝質(zhì)粒、目的基因質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞。收集24 h 和48 h 病毒。使用含病毒培養(yǎng)液和Polybrene 感染BEAS-2B 細(xì)胞，1 μg/mL 嘌呤霉素篩選，擴(kuò)增、保種及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)模型的構(gòu)建。配制10% SDS-PAGE 膠，電泳2～3 h；使用甲醇活化PVDF 膜，4 ℃恒流轉(zhuǎn)膜2～3 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；一抗冷室孵育過夜；二抗室溫孵育1 h；ECL 顯色液顯影。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)分析 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞（20 000個(gè)/孔）接種，待細(xì)胞匯合度達(dá)到95%時(shí)，無菌劃痕儀劃痕，PBS 清洗2 次，換用新鮮培養(yǎng)基。使用Incycute 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)成像儀拍照并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)分析 于上層小室中接種細(xì)胞，50 000 個(gè)/孔，上層小室和下層小室分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，孵育20 h。PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定25 min，結(jié)晶紫染色過夜。用棉簽輕柔擦掉上室細(xì)胞，PBS 清洗2 次，于顯微鏡下觀察及拍照。待液體蒸發(fā)后用10% 冰醋酸萃取，595 nm 波長下檢測(cè)吸光度值進(jìn)行定量分析。

1.2.6 RNA-seq 檢測(cè) 提取RNA 樣品后送至武漢華大基因科技有限公司檢測(cè)。

1.2.7 基因集富集分析 采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析做圖，具體操作步驟見文獻(xiàn)［22］。其中標(biāo)準(zhǔn)化富集得分（normalized enrichment score，NES）絕對(duì)值大于1，normalP＜0.05 的通路下的基因集合是有意義的。

1.2.8 RNA 提取及qPCR 檢測(cè) 參照Takara RNA 提取試劑盒說明書提取RNA，經(jīng)細(xì)胞裂解、DNA 清除、RNA 純化、洗脫、DNA 酶消化、洗脫等步驟得到50 μL RNA。使用Nanodrop 檢測(cè)RNA 樣品的R 值及濃度。配制反轉(zhuǎn)錄體系：4 μL 1.5×PrimeScript RT Master Mix+RNA 1 000 ng+無RNA 酶水。參照儀器內(nèi)反轉(zhuǎn)錄程序，關(guān)鍵步驟為37 ℃15 min，85 ℃5 s。qPCR 反 應(yīng) 體 系 配 制：6.4 μL 無RNA 酶 水+10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ+0.8 μL PCR 上 游 引 物（10 μmol/L）+0.8 μL PCR 下游引物（10 μmol/L）+2 μL cDNA。預(yù)變性條件為95 ℃反應(yīng)30 s；擴(kuò)增條件為95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)34 s，循環(huán)40 次。引物序列見表1。

表1 qPCR所用的引物序列Tab 1 Sequences of primers for qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。定量結(jié)果采用xˉ±s表示，使用student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)引起人正常肺支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)變化并增強(qiáng)其增殖能力

Western blotting 結(jié)果顯示BEAS-2B KRAS4AG12C和BEAS-2B KRAS4BG12C穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功（圖1A、1B）。Incucyte 實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞增殖變化，結(jié)果顯示與親本相比，BEAS-2B KRAS4AG12C和BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（圖1C）。為了探究KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過 表 達(dá) 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞形態(tài)的影響，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（圖1D）：BEAS-2B 對(duì)照組細(xì)胞整體形態(tài)偏圓，細(xì)胞較薄，立體結(jié)構(gòu)不明顯。BEAS-2B KRAS4AG12C細(xì)胞趨向不規(guī)則形狀生長，有偽足狀結(jié)構(gòu)生成；BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)明顯，形狀變?yōu)殚L梭形，細(xì)胞間連接增多，有偽足狀結(jié)構(gòu)生成。這些結(jié)果提示KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞增殖并引起形態(tài)改變。

圖1 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)對(duì)肺上皮細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響Fig 1 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on pulmonary epithelial cells morphology and proliferation

2.2 KRAS4BG12C引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)效果強(qiáng)于KRAS4AG12C

進(jìn)一步探究KRASG12C不同剪接體對(duì)人肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示12 h后，BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞劃痕區(qū)完全愈合，而BEAS-2B KRAS4AG12C細(xì)胞與親本細(xì)胞劃痕區(qū)尚未愈合，表明BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力顯著強(qiáng)于BEAS-2B KRAS4AG12C細(xì)胞（P=0.006）及BEAS-2B 親本細(xì)胞（P=0.000，圖2A、2B）。同樣，Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞遷移能力顯著強(qiáng)于BEAS-2B KRAS4AG12C細(xì)胞（P=0.048），且顯著強(qiáng)于BEAS-2B 親本細(xì)胞（P=0.033，圖2C、2D）。這些結(jié)果說明過表達(dá)KRAS4BG12C引起人肺支氣管上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)效果強(qiáng)于KRAS4AG12C。

圖2 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)對(duì)肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響Fig 2 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on pulmonary epithelial cells migration

2.3 KRAS4BG12C過表達(dá)促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3表達(dá)上調(diào)

為了進(jìn)一步探究過表達(dá)KRAS4BG12C促進(jìn)人肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制， 我們對(duì)BEAS-2B KRAS4AG12C過表達(dá)細(xì)胞和BEAS-2B KRAS4BG12C過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序，后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 通 路 富 集 分 析 及GSEA，尋找差異基因及信號(hào)通路變化。KEGG 分析的結(jié)果顯示，細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路排名第二（P=0.000，圖3A）。GSEA 分析的結(jié)果顯示，與BEAS-2B KRAS4AG12C過表達(dá)細(xì)胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C過表達(dá)細(xì)胞中的細(xì)胞黏附分子相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生顯著上調(diào)（P=0.002，圖3B）。使用qPCR對(duì)細(xì)胞黏附分子通路中關(guān)鍵基因CLDN1和CADM3的mRNA 水平進(jìn)行檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)與BEAS-2B KRAS4AG12C過表達(dá)細(xì)胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C過表達(dá)細(xì)胞中黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3的mRNA 水平顯著升高（P=0.000，圖3C、3D）。這些結(jié)果提示KRAS4BG12C促進(jìn)黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

圖3 KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)對(duì)黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3表達(dá)的影響Fig 3 Effects of KRAS4AG12C or KRAS4BG12C overexpression on the mRNA levels of CLDN1 and CADM3

3 討論

KRAS作為多種癌癥中的主要致癌驅(qū)動(dòng)基因，30多年來一直被認(rèn)為是不可成藥的靶點(diǎn)。近年來，KRASG12C特異性共價(jià)抑制劑AMG510 的上市給KRAS突變癌癥患者帶來了希望［23］。但KRAS基因不同剪接變體在驅(qū)動(dòng)癌癥進(jìn)展方面的分子機(jī)制以及KRAS不同基因突變類型致癌分子機(jī)制均尚未研究清楚，也增加了KRAS 抑制劑研發(fā)的難度。最近有研究報(bào)道KRAS4A 和KRAS4B 在各種癌癥細(xì)胞株中均廣泛表達(dá)，肺癌和胰腺癌細(xì)胞中以KRAS4B 表達(dá)為主，而結(jié)腸癌和黑色素瘤細(xì)胞中KRAS4A 和KRAS4B 表達(dá)水平相當(dāng)［16］。為了研究KRASG12C不同剪接變體促進(jìn)肺上皮細(xì)胞生長和運(yùn)動(dòng)的差異及其機(jī)制，我們通過慢病毒感染在人正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 中成功構(gòu)建KRAS4AG12C和KRAS4BG12C（2 種剪接體）穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)KRAS4AG12C和KRAS4BG12C過表達(dá)均引起肺上皮細(xì)胞形態(tài)變化，并且均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。于是我們提出科學(xué)假設(shè)：攜帶活化突變的KRAS4AG12C和KRAS4BG12C2 種剪接體對(duì)肺上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力有何影響？哪種惡性程度更高？引起肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力變化的分子機(jī)制如何？

為了解決這些問題，我們使用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程，結(jié)果顯示過表達(dá)KRAS4BG12C引起肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)效果強(qiáng)于過表達(dá)KRAS4AG12C。 為了進(jìn)一步探究KRAS4BG12C促進(jìn)肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，我們使用RNA-seq 方法對(duì)細(xì)胞全基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序并用GSEA 進(jìn)行基因集富集分析，尋找差異基因及信號(hào)通路變化。結(jié)果顯示與BEAS-2B KRAS4AG12C細(xì)胞相比，BEAS-2B KRAS4BG12C細(xì)胞中細(xì)胞黏附分子相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生顯著上調(diào)。使用qPCR 對(duì)細(xì)胞中黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3的表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與過表達(dá)KRAS4AG12C相比，過表達(dá)KRAS4BG12C促進(jìn)黏附相關(guān)基因CLDN1和CADM3表達(dá)上調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸癌中CLDN1高表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［24］；RAS突 變 合 并CLDN1表 達(dá) 上 調(diào) 與 肺 腺 癌 患者預(yù)后不良密切相關(guān)［25］；結(jié)腸癌中CADM3 高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)［26］。綜上，KRAS4BG12C促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)，與CLDN1 表達(dá)水平升高相關(guān)，這也與肺癌細(xì)胞系中KRAS4B 更高的表達(dá)水平相匹配。雖然KRAS4AG12C促進(jìn)肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)較弱，但KRAS4AG12C同樣可以促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖，具有一定的致癌活性。因此我們認(rèn)為，針對(duì)KRAS 突變腫瘤開發(fā)的治療策略仍然需要考慮對(duì)KRAS 2 種蛋白剪接體的抑制作用。

本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探究了KRAS4AG12C和KRAS4BG12C促進(jìn)人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 生長和運(yùn)動(dòng)的差異，即初步證明人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，關(guān)于是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化還需體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。 而KRAS4AG12C和KRAS4BG12C2 種剪接體之間的這種差異與其哪個(gè)功能區(qū)相關(guān)，還需構(gòu)建蛋白截?cái)囿w及失活突變過表達(dá)細(xì)胞模型進(jìn)一步深入探究。

綜上，本研究表明KRAS4AG12C和KRAS4BG12C均可促進(jìn)人肺上皮細(xì)胞增殖，KRAS4BG12C促進(jìn)肺上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)，并初步探究了相關(guān)分子機(jī)制。本研究進(jìn)一步揭示了KRASG12C不同剪接體在肺癌中生物學(xué)差異的分子機(jī)制，為KRAS特異性靶向抑制劑的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

沈瑛和鄒菁華參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；沈瑛、鄒菁華、宮淼淼參與論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意最終稿件的提交。

The study was designed by SHEN Ying and ZOU Jinghua. The manuscript was drafted and revised by SHEN Ying，ZOU Jinghua and GONG Miaomiao. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-10

·Accepted：2022-03-08

·Published online：2022-04-26

參·考·文·獻(xiàn)

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