汪席均，金安婷，黃湘如，徐弘遠(yuǎn)，高 昕，楊屹羚，代慶剛，江凌勇

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔顱頜面外科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔第二門診部，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011

正 畸 牙 移 動(dòng) （orthodontic tooth movement，OTM）的生理學(xué)基礎(chǔ)是正畸應(yīng)力作用下的牙周改建，包括壓力區(qū)牙周膜的壓縮及舊牙槽骨基質(zhì)的吸收、張力區(qū)牙周膜的拉伸及新骨基質(zhì)的形成［1］。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是存在于牙周膜中重要的成體牙源性干細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性［2］，其能夠響應(yīng)正畸應(yīng)力，并在該應(yīng)力刺激下的牙周改建中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。長久以來，在OTM 領(lǐng)域中，應(yīng)力調(diào)控PDLSCs 重塑牙周組織的機(jī)制研究是諸多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。既往，國內(nèi)外學(xué)者多采用傳統(tǒng)方法如體外細(xì)胞加力、體內(nèi)簡單動(dòng)物模型構(gòu)建等開展研究，但由于體內(nèi)外環(huán)境的差異、體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜性、生長發(fā)育的影響等，PDLSCs 在應(yīng)力刺激下的真實(shí)轉(zhuǎn)歸與其重塑牙周組織的機(jī)制難以被深入解析。

細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)是一項(xiàng)利用各種方式對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并對包括該細(xì)胞的后代所有細(xì)胞的增殖、分化及遷移等活動(dòng)進(jìn)行追蹤觀察的技術(shù)。目前譜系示蹤技術(shù)包括以下幾種：直接顯微鏡觀察法示蹤技術(shù)、細(xì)胞移植示蹤技術(shù)、Y 染色體示蹤標(biāo)記、染料和放射性示蹤劑標(biāo)記、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、MRI 磁性標(biāo)記成像技術(shù)、基因打靶和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等［4-5］。近年來，基因打靶和轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于對外源標(biāo)志物基因?qū)氚屑?xì)胞的示蹤，其克服了傳統(tǒng)物理標(biāo)記中的細(xì)胞損傷及標(biāo)記稀釋等問題，但需利用基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶序列［6］。目前在位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)中，Cre/loxP 和FLP/FRT 重組酶系統(tǒng)使用最為廣泛；其中，Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)效率更高，且根據(jù)時(shí)間是否可控分為一般型和誘導(dǎo)型。與一般型相比，誘導(dǎo)型Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)可在特定時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)激活重組酶，實(shí)現(xiàn)對該時(shí)間點(diǎn)被標(biāo)記細(xì)胞的增殖、分化及遷移活動(dòng)的觀察。當(dāng)前，已有眾多學(xué)者利用細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)研究體內(nèi)某一特定分子的作用，如利用Gli1-CreERT2小鼠的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1 （glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1） 可標(biāo)記骨形成和骨折修復(fù)的成骨祖細(xì)胞［7］，通過Gli1-CreERT2小鼠的研究發(fā)現(xiàn)圍繞牙槽骨脈管系統(tǒng)的Gli1+細(xì)胞是支持種植體骨整合的干細(xì)胞［8］，利用Osx-CreERT2小鼠的研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix，Osx）可標(biāo)記骨發(fā)育中的祖細(xì)胞［9］。

配對相關(guān)同源基因1（paired related homeobox 1，Prrx1）是編碼轉(zhuǎn)錄因子的同源盒基因，在小鼠間充質(zhì)中廣泛表達(dá)。有研究［10］顯示，Prrx1+細(xì)胞在顱頜面及四肢骨骼的發(fā)育中均發(fā)揮了重要作用。且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Prrx1存在于小鼠切牙及磨牙的PDLSCs 中，并參與了小鼠切牙及磨牙的發(fā)育、牙周膜的組織修復(fù)再生和持續(xù)改建的過程［11-12］。因此，本研究基于Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建誘導(dǎo)型條件性熒光表達(dá)小鼠，并創(chuàng)新性地將細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)與體內(nèi)OTM 模型相結(jié)合，通過免疫熒光染色觀察Prrx1+細(xì)胞譜系在正畸應(yīng)力作用下的動(dòng)態(tài)分布，為今后深入研究Prrx1在牙移動(dòng)過程中的功能提供新的模型與方法。

1 對象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡、雄性誘導(dǎo)型Prrx1-CreERT2小鼠由上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院李保界教授惠贈(zèng)，體質(zhì)量約20 g。6 周齡、雌性R26tdTomato熒光標(biāo)記小鼠購買于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，體質(zhì)量為20～25 g，生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2018-0008。將上述2 種小鼠作為種鼠，以雄性∶雌性=1∶2 進(jìn)行交配繁殖，獲得的子代小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

子代小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF級動(dòng)物房，使用許可證：SYXK（滬）2020-0025。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃、濕度（60±5）%、12 h晝夜循環(huán)、自由飲水，并行常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

PCR 儀（BioRad，美國），凝膠成像系統(tǒng)（GE Healthcare，美國），冰凍切片機(jī)（Leica，美國），正置熒光顯微鏡（Olympus，日本）。他莫昔芬（上海昂一生物科技有限公司），DAPI染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Alexa Fluor 555 標(biāo)記的驢抗兔多克隆抗體IgG （Invitrogen，美國），RFP 抗體（Rockland，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 子代小鼠基因型的鑒定 出生2周后，取子代小鼠尾部末端1～2 mm 組織，加入裂解液及蛋白酶K后置于55 ℃恒溫水浴鍋過夜。而后，向其中加入等量異丙醇，出現(xiàn)絮凝的DNA 沉淀后于10 000×g離心10 min，棄上清液，用ddH2O 溶解沉淀。采用常規(guī)PCR對小鼠的基因型進(jìn)行鑒定，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

1.3.2 子代小鼠牙周膜中Prrx1+細(xì)胞譜系的標(biāo)記、OTM 模型的構(gòu)建及分組 取8 只、2 周齡的子代小鼠，于腹腔注射他莫昔芬（10 mg/mL），劑量為200 mg/kg［13］，每間隔2 d 注射1 次，連續(xù)注射3 次。如小鼠牙周膜中的Prrx1+細(xì)胞譜系均表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，則細(xì)胞標(biāo)記完成（即為tdTomato+細(xì)胞）。

當(dāng)Prrx1+細(xì)胞譜系被標(biāo)記1周后，構(gòu)建小鼠OTM模型，具體方法參考本課題組的既往報(bào)道［14］。即將自制加力裝置的一端結(jié)扎固定于左側(cè)上頜第一磨牙，另一端結(jié)扎后用樹脂固定于上頜切牙；放置加力裝置的一側(cè)為OTM 側(cè)，未放置的一側(cè)為對照側(cè)。每日對小鼠口內(nèi)牙移動(dòng)裝置是否完整、無脫落檢查1次。

分別于牙移動(dòng)第3 日（OTM 3 d）、第7 日（OTM 7 d）時(shí)處死小鼠（即OTM 3 d 組、OTM 7 d組），收集其雙側(cè)上頜第一磨牙及周圍牙周組織，通過體視鏡觀察并測量上頜第一磨牙（M1）及第二磨牙（M2）間距離。

1.3.3 上頜第一磨牙及牙周組織的冰凍切片的獲取 將收集的小鼠雙側(cè)上頜第一磨牙及周圍牙周組織浸入4%多聚甲醛中固定，并于4 ℃過夜。次日，將其置于10% EDTA（pH7.4）脫鈣液中進(jìn)行脫鈣。當(dāng)上頜第一磨牙可被針尖輕易穿透，視為脫鈣完成。隨后，將其轉(zhuǎn)入含有20%的蔗糖與2%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）的混合溶液中進(jìn)行脫水，再用8%明膠、20%蔗糖和2%PVP的混合冰凍包埋劑進(jìn)行包埋［15］。使用冰凍切片機(jī)在平行于上頜第一磨牙近遠(yuǎn)中方向進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為10～12 μm，用于后續(xù)觀察。

1.3.4 冰凍切片的染色分析 采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H-E 染色）對OTM 3 d及OTM 7 d小鼠雙側(cè)上頜第一磨牙近中（壓力區(qū)）和遠(yuǎn)中（張力區(qū)）的牙周膜進(jìn)行觀察。取“1.3.3”制備的冰凍切片進(jìn)行固定，于蘇木精染液中染色30～60 s，再用1%鹽酸乙醇處理1 s后水洗終止反應(yīng)。待切片返藍(lán)后，加入伊紅染液染色20 s，再依次行乙醇梯度脫水、二甲苯中透明、中性樹脂封片。而后，于光鏡下觀察OTM 3 d、OTM 7 d 小鼠壓力區(qū)及張力區(qū)中牙周膜的改變。

1.3.5 冰凍切片的免疫熒光染色分析 采用免疫熒光染色對OTM 3 d及OTM 7 d小鼠雙側(cè)上頜第一磨牙近中（壓力區(qū)）和遠(yuǎn)中（張力區(qū)）的牙周膜進(jìn)行觀察。取“1.3.3”制備的冰凍切片，行抗原修復(fù)，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗后滴加封閉液，于室溫封閉1 h，而后滴加RFP 抗體（1∶1 000） 于4 ℃孵育過夜。次日，加入Alexa Fluor 555 標(biāo)記的IgG 抗體（1∶1 000）于室溫孵育2 h。采用DAPI染色后封片，于共聚焦顯微鏡下觀察Prrx1+細(xì)胞譜系在壓力區(qū)及張力區(qū)的動(dòng)態(tài)分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子代小鼠基因型的鑒定及OTM模型的構(gòu)建

采用PCR對子代小鼠的基因型進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）顯示，小鼠基因型為Prrx1-CreERT2；R26tdTomato。

圖1 PCR檢測子代小鼠基因型Fig 1 Detection of genotype of offspring mice by PCR

通過向子代小鼠的腹腔注射他莫昔芬，獲得Prrx1+細(xì)胞譜系小鼠。隨后，依據(jù)圖2A 所示，建立OTM 模型。所有構(gòu)建OTM 模型的Prrx1-CreERT2；R26tdTomato小鼠均全程耐受，可自由飲水、進(jìn)食軟食。于體視鏡下對小鼠OTM 側(cè)M1 與M2 間距離進(jìn)行觀察并測量，結(jié)果（圖2B）顯示，OTM 側(cè)M1 發(fā)生了明顯的近中移動(dòng)，M1 與M2 間距離隨正畸應(yīng)力作用時(shí)間而增加，即OTM 7 d 時(shí)的間隙［（87.44±4.02）μm］大于OTM 3 d 時(shí)［（42.81±5.04）μm］。因此，本研究的牙移動(dòng)規(guī)律符合先前的研究報(bào)道［16］，表明OTM模型構(gòu)建成功。

圖2 子代小鼠OTM模型的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig 2 Construction and validation of OTM model in offspring mice

2.2 壓力區(qū)牙周膜的改變及Prrx1+細(xì)胞譜系的表達(dá)

正畸應(yīng)力作用下，采用H-E染色對切片的壓力區(qū)進(jìn)行觀察，觀察區(qū)域如圖3A 所示。結(jié)果（圖3B）顯示：OTM 3 d 時(shí)，小鼠OTM 側(cè)壓力區(qū)的牙周膜間隙變窄、纖維及管腔被壓縮；OTM 7 d 時(shí)，OTM 側(cè)的牙周膜發(fā)生改建，寬度逐漸被恢復(fù)。采用免疫熒光染色對OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側(cè)及對照側(cè)的壓力區(qū)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3C、3D）顯示：OTM 3 d 小鼠的OTM 側(cè)壓力區(qū)的牙周膜中tdTomato+細(xì)胞數(shù)量［（6.35±2.15）%］較對照側(cè)［（13.26±3.02）%］有所減少（P=0.007），OTM 7 d小 鼠 的OTM 側(cè)tdTomato+細(xì) 胞 數(shù) 量［ （60.41±4.59）%］較對照側(cè)［（20.74±2.62）%］有所增加（P=0.000）；且隨著正畸應(yīng)力作用時(shí)間的增加，OTM側(cè)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量亦逐漸增加（P=0.000），在OTM 7 d 時(shí)tdTomato+細(xì)胞已廣泛分布于壓力區(qū)牙周膜內(nèi)。

圖3 壓力區(qū)牙周膜的改變及Prrx1+細(xì)胞譜系的表達(dá)Fig 3 Changes of periodontal ligament and expression of Prrx1+cell lineage in the compression area

2.3 張力區(qū)牙周膜的改變及Prrx1+細(xì)胞譜系的表達(dá)

正畸應(yīng)力作用下，采用H-E染色對切片的張力區(qū)進(jìn)行觀察，觀察區(qū)域如圖4A 所示。結(jié)果（圖4B）顯示：OTM 3 d 時(shí)，小鼠OTM 側(cè)張力區(qū)的牙周膜被拉伸，牙周膜間隙增寬；OTM 7 d 時(shí)OTM 側(cè)的牙周膜排列較OTM 3 d 時(shí)更加規(guī)則。采用免疫熒光染色對OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側(cè)及對照側(cè)的張力區(qū)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4C、4D）顯示：OTM 3 d 小鼠的OTM 側(cè)張力區(qū)的牙周膜中tdTomato+細(xì)胞數(shù)量［（44.48±3.87）%］ 較對照側(cè)［（13.64±2.07）%］ 有所增加，OTM 7 d 小鼠的OTM 側(cè)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量［（66.88±6.42）%］較對照 側(cè)［（20.90±5.78）%］ 亦 有 所 增 加（均P=0.000）；且隨著正畸應(yīng)力作用時(shí)間的增加，OTM 側(cè)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量逐漸增多（P=0.001），在OTM 7 d時(shí)tdTomato+細(xì)胞已廣泛分布于張力區(qū)牙周膜內(nèi)。

圖4 張力區(qū)牙周膜的改變及Prrx1+細(xì)胞譜系的表達(dá)Fig 4 Changes of periodontal ligament and expression of Prrx1+cell lineage in the tension area

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及人民健康意識的增加，牙頜面畸形的診療需求與日俱增。如何安全有效地縮短正畸治療周期、減少正畸復(fù)發(fā)與并發(fā)癥的發(fā)生，一直是正畸學(xué)者密切關(guān)注的熱點(diǎn)。OTM 是基于牙槽骨重塑的過程，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）及PDLSCs 在其過程中起到了重要作用。BMSCs 是體內(nèi)骨細(xì)胞的主要來源［17］，在應(yīng)力刺激下可直接誘導(dǎo)成骨向分化，且分化后的成骨細(xì)胞會(huì)分泌相關(guān)因子間接調(diào)控破骨細(xì)胞；而PDLSCs 是存在于牙周膜中的力學(xué)敏感的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞，可直接感知正畸應(yīng)力并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活動(dòng)，同時(shí)其還可在正畸應(yīng)力下誘導(dǎo)牙周膜的增殖和分化、調(diào)節(jié)牙周膜穩(wěn)態(tài)［18］。在體內(nèi)PDLSCs 所處的微環(huán)境較為復(fù)雜，體外研究尚無法反映該細(xì)胞的真實(shí)生物學(xué)行為，因此在體內(nèi)對PDLSCs 進(jìn)行標(biāo)記與追蹤是研究該細(xì)胞在正畸應(yīng)力下調(diào)控牙周改建的前提。

譜系示蹤是一項(xiàng)針對單個(gè)細(xì)胞及其全部后代細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記及鑒定，以探究該細(xì)胞的譜系發(fā)生，并對其后代細(xì)胞的數(shù)量、位置、分化狀態(tài)等進(jìn)行追蹤觀察的技術(shù)。作為譜系示蹤技術(shù)中使用較為廣泛的重組酶系統(tǒng)，Cre/loxP 系統(tǒng)可在報(bào)告基因前插入loxP-STOPloxP 序列，當(dāng)Cre 重組酶被激活時(shí)，其可切除插入序列中的STOP 序列，使報(bào)告基因在所有表達(dá)Cre 重組酶的細(xì)胞及其后代細(xì)胞中表達(dá)［19］；同時(shí)，Cre重組酶還可與突變的ER（Cre-ER）相結(jié)合，當(dāng)給予他莫昔芬后，Cre-ER 能夠進(jìn)入細(xì)胞核并發(fā)揮重組效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對誘導(dǎo)型特異性熒光蛋白的標(biāo)記［20］。近年來，誘導(dǎo)型細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)已成為研究干細(xì)胞譜系發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵技術(shù)，這也為本課題組突破現(xiàn)有的牙移動(dòng)機(jī)制研究提供了有力工具。然而在OTM 領(lǐng)域中，鮮少有利用譜系示蹤技術(shù)進(jìn)行研究的報(bào)道。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)PDLSCs 的特異性標(biāo)志物。既往研究中，部分學(xué)者使用軸向抑制蛋白2 （axis inhibition protein 2，Axin2）、Gli1及Prrx1對PDLSCs進(jìn)行標(biāo)記。在成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中Axin2表達(dá)廣泛［21］，使得其對PDLSCs 的特異性不足。而Gli1+及Prrx1+細(xì)胞在牙周膜改建、小鼠磨牙生長中發(fā)揮了重要作用。其中，Prrx1是編碼轉(zhuǎn)錄因子的同源盒基因，在顱面部骨骼發(fā)育和胚胎肢芽形成中高度表達(dá)［22］，敲除Prrx1基因則會(huì)導(dǎo)致小鼠牙頜面骨發(fā)育障礙［23-26］；同時(shí)，Prrx1還參與維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力，高表達(dá)于小鼠間充質(zhì)細(xì)胞［27］。這些研究均提示，Prrx1具備干細(xì)胞標(biāo)志物的條件，或參與了牙周組織的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持及修復(fù)再生。基于此，本研究選用Prrx1基因作為小鼠PDLSCs 的研究標(biāo)志物，構(gòu)建Prrx1+細(xì)胞譜系示蹤小鼠OTM 體內(nèi)力學(xué)模型，追蹤Prrx1+細(xì)胞在應(yīng)力作用下的改變；通過H-E 染色、免疫熒光染色觀察后發(fā)現(xiàn)，tdTomato+細(xì)胞能夠標(biāo)記PDLSCs，且OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側(cè)張力區(qū)tdTomato+細(xì)胞數(shù)量均較對照側(cè)有顯著增加。

本研究成功構(gòu)建了誘導(dǎo)型Prrx1+細(xì)胞譜系示蹤小鼠的牙移動(dòng)模型，初步證實(shí)了Prrx1+細(xì)胞譜系參與OTM 的牙周改建。后續(xù)，我們將對成骨、破骨及成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物進(jìn)行檢測，對Prrx1+細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸行進(jìn)一步探究。值得注意的是，作為牙源性干細(xì)胞，PDLSCs 具有一定的異質(zhì)性，存在于多個(gè)不同的功能亞群。未來，我們還將利用單細(xì)胞測序技術(shù)，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對PDLSCs 進(jìn)行精確分群，并對其組織特異性標(biāo)志物進(jìn)行篩選及鑒定，為牙周組織的再生提供新思路。此外，本研究構(gòu)建的Prrx1-CreERT2；R26tdTomato小鼠還可用于牙周損傷、牙周炎等模型的分析，以標(biāo)記并追蹤PDLSCs 參與的其他重要生物學(xué)過程及譜系轉(zhuǎn)歸。

綜上，本研究實(shí)現(xiàn)了在正畸應(yīng)力作用下，時(shí)空特異性標(biāo)記、追蹤牙源性干細(xì)胞PDLSCs，是國內(nèi)利用譜系示蹤技術(shù)結(jié)合OTM 模型的較早探索，或?qū)檠酪苿?dòng)機(jī)制研究提供全新的動(dòng)物模型與較理想的研究策略。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院科學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（SH9H-2020-A235-1）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No. SH9H-2020-A235-1，dated 03/03/2020），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines ofInstructive Notions with Respect to Caring for Laboratory Animals.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

汪席均負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)整理分析、論文撰寫；金安婷參與論文的寫作和修改；黃湘如負(fù)責(zé)動(dòng)物培育及基因型鑒定；徐宏遠(yuǎn)、高昕負(fù)責(zé)資料收集與分析；楊屹羚負(fù)責(zé)購買試劑、參與實(shí)驗(yàn)分析；代慶剛、江凌勇參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及指導(dǎo)。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The experiment，data compilation and analysis and paper writing were completed by WANG Xijun. The participation in writing and revising was done by JIN Anting. The animal breeding and genotype identification was done by HUANG Xiangru. The data collection and analysis were performed by XU Hongyuan and GAO Xin. The purchase of reagents and the participation in the experimental analysis were done by YANG Yiling. The study was designed by JIANG Lingyong and DAI Qinggang.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-04-14

·Accepted：2022-08-13

·Published online：2022-08-28

參·考·文·獻(xiàn)

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