廖雅慧，劉麗云，朱泓睿，林厚文，嚴(yán)繼舟，孫 凡#

1.上海海洋大學(xué)海洋生物與組織再生實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院海洋藥物實(shí)驗(yàn)室，上海200127；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院藥劑科，上海 200011

肺癌的發(fā)病率和死亡率均高居全球惡性腫瘤之首。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料表明，2020 年全球肺癌發(fā)病人數(shù)220萬，死亡人數(shù)亦高達(dá)180萬［1］。肺癌在臨床上分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中，NSCLC 包括肺腺癌（adenocarcinoma）、肺鱗癌（squamous cell carcinoma）和大細(xì)胞肺癌（large-cell carcinoma），占肺癌總數(shù)的85%［1］。NSCLC 治療的方法主要有手術(shù)治療和化學(xué)治療（化療），近年來靶向藥物和免疫治療的應(yīng)用也逐漸廣泛。但許多NSCLC 患者在最初就被診斷為ⅢB 或Ⅳ期，或在手術(shù)后復(fù)發(fā)［2］，靶向藥物如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）和免疫抑制劑如程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）抑制劑的用藥指征尚不明確，因此化療仍然是目前主要的治療方法。由于腫瘤出現(xiàn)化療耐藥，NSCLC 患 者 的5 年 生 存 率 僅 為26%［3］。以 順 鉑（cisplatin， cis-diamminedichloroplatinum， DDP） 為基礎(chǔ)的治療方案是晚期NSCLC 治療中應(yīng)用最廣泛的方案［4］。因此，尋找逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的方法是NSCLC治療中亟待解決的關(guān)鍵問題。目前，順鉑耐藥的主要原因有：癌細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）蛋白的過度表達(dá)以及癌細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗［5-7］。在多藥耐藥機(jī)制中，ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）蛋白的過度表達(dá)被認(rèn)為是最常見的［8］。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少15種ABC 蛋白，這些蛋白形成藥物外排泵，與介導(dǎo)MDR 有關(guān)［9］。一項(xiàng)對(duì)結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥株的研究［10］發(fā)現(xiàn)，與母本細(xì)胞相比，耐藥株中ABC 蛋白G超家族成員2 （ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2） 表達(dá)水平明顯增高，加入ABCG2抑制劑維拉帕米可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）信號(hào)通路通過對(duì)細(xì)胞外刺激做出應(yīng)答，參與調(diào)控增殖、生長、存活、運(yùn)動(dòng)性和代謝等多種細(xì)胞功能，該通路的異常激活是加速癌癥發(fā)展的因素。Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)因子之一，最初被認(rèn)為是胰島素受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分。有研究者［11］發(fā)現(xiàn)，Akt1 在肺腺癌細(xì)胞A549 順鉑耐藥株中過表達(dá)，并通過調(diào)控Rapamycin/p70S6K1信號(hào)通路產(chǎn)生耐藥。當(dāng)抑制Akt1 活性時(shí)，耐藥株對(duì)順鉑的敏感性顯著增加。

Smenospongine （SME） 是 本 實(shí) 驗(yàn) 室 從 海 綿Spongia pertusaesper 中分離得到的一種倍半萜氨基醌［12］。據(jù)報(bào)道［13-14］，SME 可誘導(dǎo)K562 細(xì)胞紅系分化，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的G1 期阻滯和凋亡。其他研究［15-16］也報(bào)道了SME 在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗增殖和抗血管生成活性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究［17］發(fā)現(xiàn)SME 對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞有抑制作用。然而，SME對(duì)NSCLC順鉑耐藥的作用和機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究構(gòu)建了NSCLC順鉑耐藥株A549/DDP，并深入探討了SME對(duì)該耐藥株的抑制作用和分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞 人NSCLC 系A(chǔ)549 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP 購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM F12k 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、10%胎牛血清購自美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購于日本東仁化學(xué)；RNA Simple Total RNA Kit 購于北京天根生物科技公司，Prime Script RNA RT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ（Tli RNAseH Plus）購于日本Takara 公司；順鉑、吉西他濱（gemcitabine，GEM）、培美曲塞、酒石酸長春瑞濱（vinorelbine，NVB）購于美國Selleck 公司；魚藤素（deguelin）購于上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購于美國Gibco公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；抗E-cadherin、N-cadherin、鋅指轉(zhuǎn)錄因子slug（SNAI2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2 xL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma 2 xL，Bcl-xL）、Akt、p-Akt、EGFR、p-EGFR、甘油醛-3- 磷 酸 脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體，抗兔IgG，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗和抗鼠IgG 購自美國Cell Signaling Technology 公司；抗ABCG2抗體購于英國Abcam公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、結(jié)晶紫染色液和TUNEL （TdTmediated dUTP Nick-end labeling）試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司； 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Merck Millipore 公司；封閉液購于美國Odyssey 公司；PI/RNAse染色液和Transwell小室購于美國BD公司。

SME 的提取和分離由本實(shí)驗(yàn)室從南海海綿Spongia pertusaesper中分離得到，其結(jié)構(gòu)和純度已由本實(shí)驗(yàn)室確定，SME的純度超過98%［17］。

二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo Fisher Scientific公司；核酸和蛋白分析儀購于美國Beckman公司；Amersham Imager 600 超靈敏多功能成像儀購于美國GE 公司；熒光定量PCR 儀Light Cycler 480 購于瑞士Roche 公司；-80 ℃低溫冰箱、流式細(xì)胞儀購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC 細(xì)胞A549 培養(yǎng)于DMEM F12k 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素）中，A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1 μg/mL 順鉑）中，2種細(xì)胞均于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁之后，分別加入順鉑、GEM、培美曲塞、NVB和5-氟尿嘧啶等抗癌藥物。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，繼續(xù)避光45 min。隨后以酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力，最后繪制不同時(shí)間細(xì)胞的生長曲線。

1.2.3 克隆形成試驗(yàn) 采用結(jié)晶紫染色和定量方法進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)細(xì)胞的密度種植在6孔板中。37 ℃培養(yǎng)48 h后加入藥物。藥物處理8～9 d，每3 d 更換含藥培養(yǎng)基。最后細(xì)胞用4%甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 將收集的細(xì)胞樣品加入RIPA蛋白裂解液，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度；取12 μg總蛋白量上樣至SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移SDS-PAGE 膠至PVDF 膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)A549 和A549/DDP 經(jīng)處理后ABCG2的mRNA 表達(dá)水平 用試劑盒提取總RNA、Prime Script RNA RT 試劑盒合成cDNA。實(shí)時(shí)熒 光 定 量PCR （quantitative real-time PCR， qRTPCR） 的10 μL 擴(kuò)增體系：5 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ（2×），1 μL RT 反應(yīng)液（cDNA 溶液）、上下引物各0.2 μL，3.6 μL dH2O（滅菌蒸餾水）。程序設(shè)置為：95 ℃3 min；95 ℃5 s，60 ℃25 s，72 ℃25 s，循環(huán)數(shù)為40 次。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法對(duì)2 株細(xì)胞的ABCG2、β-actin 表達(dá)水平進(jìn)行分析。所設(shè)計(jì)的ABCG2的上游和下游引物分別為5'-GGAT GAGCCTACAACTGGCTT-3'、 5'-TTCCTGAGGCCA ATAAGGTG-3'；β-actin 的上游和下游引物分別為5'-CCTGGCACCCAGCAGCAAT-3'、 5'-GGGCCGGAC TCGTCATAC-3'。

1.2.6 細(xì)胞周期分析 將細(xì)胞暴露于不同濃度的SME 中24 h 后，用70%乙醇固定，置于-20 ℃過夜。采用PI-RNase 溶液避光染色15 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。并用Modfit軟件分析細(xì)胞周期分布以及繪圖。

1.2.7 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中，按說明用TUNEL 試劑盒染色。熒光信號(hào)在熒光顯微鏡上捕捉。

1.2.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸接種于Transwell上室，下室加入500 μL含10%血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，并將小室適當(dāng)風(fēng)干，于顯微鏡下觀察，拍照，并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。定量資料用表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析2組數(shù)據(jù)間的差異；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑耐藥株A549/DDP的鑒定

我們首先利用順鉑誘導(dǎo)獲得A549/DDP 細(xì)胞并對(duì)其耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)順鉑在A549和A549/DDP細(xì)胞中的IC50檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示，發(fā)現(xiàn)A549 的IC50為3.73 μmol/L，而A549/DDP 的IC50為155.10 μmol/L，即A549/DDP 是A549 的41.55 倍，表 明A549/DDP 細(xì)胞對(duì)高濃度的順鉑具有耐藥性。為了檢測(cè)A549/DDP對(duì)其他藥物的反應(yīng)，我們檢測(cè)了一些臨床上常用的一線NSCLC 化療藥物［GEM、NVB、培美曲塞和5-氟尿嘧啶（5-FU）］對(duì)2 種細(xì)胞的IC50。結(jié)果如表1 所示。我們利用GEM、NVB 和培美曲塞同時(shí)處理2 株細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A549/DDP 的耐藥指數(shù)分別是A549 的5.050 倍、895.000 倍以及6.342 倍。結(jié)果提示A549/DDP與母本細(xì)胞相比獲得了MDR特性。

表1 順鉑耐藥株的MDR特性Tab 1 MDR features of cisplatin-resistant cells

圖1 順鉑耐藥株的鑒定Fig 1 Authentication of cisplatin-resistant cells

2.2 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究SME 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的作用，我們用SME 處理A549 和A549/DDP 細(xì)胞，以CCK-8 檢測(cè)了細(xì)胞對(duì)SME 的IC50。結(jié)果可見，SME 對(duì)A549/DDP的IC50與A549 十分接近，甚至小于A549（圖2A），提示SME 對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞的增殖有抑制作用，甚至優(yōu)于母本細(xì)胞。進(jìn)一步利用克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SME對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。圖2B 可見，在對(duì)照組中A549 和A549/DDP 的克隆有明顯的差異（圖2B 左）。然而，當(dāng)分別用5 和20 μmol/L SME 處理細(xì)胞時(shí)，克隆形成明顯減少（圖2B中和右），幾乎與母本細(xì)胞相同。上述結(jié)果提示SME 可有效抑制A549/DDP 細(xì)胞增殖。

為了研究SME 對(duì)A549/DDP 遷移能力影響，我們進(jìn)行了Transwell 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，5 和20 μmol/L SME 能明顯抑制A549/DDP 細(xì)胞的遷移能力（圖2C）。此外，利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與A549 細(xì)胞相比，A549/DDP 細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白水平較低，而間質(zhì)標(biāo)志物slug 和N-cadherin 較高（圖2D）。提示在耐藥細(xì)胞中發(fā)生了EMT。隨后我們用0、5、10 和20 μmol/L SME 分別處理A549/DDP 24 h，隨著實(shí)驗(yàn)中SME 濃度的增加，A549/DDP 細(xì)胞E-cadherin 蛋白水平升高，slug 和N-cadherin 蛋白水平則逐漸下調(diào)（圖2E），提示SME可有效抑制耐藥細(xì)胞EMT和遷移能力。

圖2 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移Fig 2 SME inhibits cell proliferation and EMT in cisplatin-resistant cells

上述結(jié)果表明，SME 可有效抑制順鉑耐藥細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，抑制耐藥細(xì)胞的增長。

2.3 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞ABCG2基因表達(dá)

為了揭示SME 抑制耐藥細(xì)胞的機(jī)制，我們研究了SME 作用下，A549/DDP 細(xì)胞中與MDR 密切相關(guān)的ABC 家族蛋白水平的變化。利用0、5、10 和20 μmol/L SME 分 別 處 理A549/DDP 細(xì) 胞，采 用Western blotting 檢 測(cè)ABCC11 和ABCB1 蛋 白 水 平（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SME 的作用下，ABCC11 和ABCB1 均無明顯差別。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理A549 和A549/DDP 24 h 后，ABCG2 蛋白水平呈SME 濃度梯度依賴性下調(diào)，SME濃度越高，對(duì)ABCG2 蛋白抑制越明顯。同時(shí)結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞中的ABCG2 水平明顯高于母本細(xì)胞（圖3B）。為了檢測(cè)SME是否影響ABCG2的mRNA水平，我 們 對(duì)A549 和A549/DDP 中ABCG2進(jìn) 行 了qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以20 μmol/L SME處理，可顯著降低A549 和A549/DDP 中ABCG2mRNA 水平（圖3C）。這些結(jié)果表明，SME 可抑制ABCG2的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而減少蛋白表達(dá)，A549/DDP的耐藥性可能與ABCG2上調(diào)相關(guān)。

圖3 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞ABCG2基因表達(dá)Fig 3 SME inhibits the mRNA expression of ABCG2 in cisplatin-resistant cells

2.4 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞EGFR-Akt信號(hào)通路活性

為了深入探究SME 抑制耐藥株的分子機(jī)制，我們用Western blotting檢測(cè)了與細(xì)胞代謝、生長和增殖相關(guān)的信號(hào)通路的活性，包括p38、AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、PI3K 等（數(shù)據(jù)未顯示）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用SME 處理后，磷酸化Akt（p-Akt）明顯降低。相一致的是，以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理后，受Akt抑制的下游蛋白forkhead box protein O1（FoxO1）在A549 和A549/DDP 中明顯增加（圖4A）。為了進(jìn)一步證實(shí)SME 對(duì)Akt 磷酸化水平的抑制作用，我們利用Akt 抑制劑deguelin 和SME 處理母本細(xì)胞和耐藥株；結(jié)果顯示，250 nmol deguelin 和20 μmol/L SME均可抑制p-Akt，同時(shí)上調(diào)FoxO1 蛋白。二者同時(shí)處理細(xì)胞后，對(duì)p-Akt 的抑制作用更加顯著，提示deguelin 和SME 對(duì)抑制p-Akt 有協(xié)同作用（圖4B）。進(jìn)一步對(duì)Akt 與ABCG2 的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行探究，結(jié)果顯 示，250 nmol deguelin 和20 μmol/L SME 可 抑 制A549 和A549/DDP 中ABCG2 蛋白水平，并且二者對(duì)ABCG2 的抑制也有協(xié)同作用（圖4C）。這些結(jié)果提示Akt 是ABCG2 的上游調(diào)控信號(hào)，Akt 上調(diào)ABCG2的同時(shí)抑制FoxO1。SME 通過抑制Akt 信號(hào)而下調(diào)ABCG2，同時(shí)上調(diào)FoxO1。

為了進(jìn)一步檢測(cè)SME 可能的抑制靶點(diǎn)，我們檢測(cè)了Akt 上游蛋白EGFR 的活性。我們用100 nmol EGF 處理細(xì)胞以激活EGFR，結(jié)果表明20 μmol/L SME 可降低EGF 激活的磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白水平（圖4D）。提示SME 可通過抑制EGFR 活性，進(jìn)而抑制下游Akt-ABCG2信號(hào)通路。

圖4 SME抑制順鉑耐藥細(xì)胞EGFR-Akt信號(hào)通路活性Fig 4 SME inhibits the activity of EGFR-Akt pathway in cisplatin-resistant cells

2.5 SME 誘導(dǎo)順鉑耐藥細(xì)胞G0/G1 期阻滯和細(xì)胞凋亡

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡是多種化療藥物的作用機(jī)制［18］。為了研究SME 對(duì)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響，我們首先采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì) 胞 周 期；如 圖5A 和5B 所 示，20 μmol/L SME 使A549 的G0/G1 期細(xì)胞比例從55.79%升至81.00%，而A549/DDP 的G0/G1 期 細(xì) 胞 比 例 從64.41% 升 至74.63%。表明SME 可誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1 期阻滯。進(jìn)一步利用TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，以20 μmol/L SME 處理后，提示凋亡的綠色熒光信號(hào)明顯增多（圖5C、5D）。隨后我們利用Western blotting檢測(cè)凋亡蛋白，發(fā)現(xiàn)分別以0、5、10 和20 μmol/L SME 處理后，A549/DDP 中促凋亡蛋白Bax 增加而抗凋亡蛋白Bcl-xL 降低（圖5E），與TUNEL 結(jié)果相一致。該結(jié)果表明SME可誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡。

圖5 SME誘導(dǎo)順鉑耐藥細(xì)胞G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡Fig 5 SME induces G0/G1 arrest and apoptosis in cisplatin-resistant cells

綜上所述，SME 可通過抑制EGFR-Akt-ABCG2信號(hào)通路，抑制MDR基因ABCG2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)受Akt 抑制的下游蛋白FoxO1，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而抑制A549/DDP 的增長（圖6）。

圖6 SME抑制EGFR-Akt-ABCG2信號(hào)通路模式圖Fig 6 A schematic diagram depicting a model of the inhibition of SME on the EGFR-Akt-ABCG2 pathway

3 討論

化療耐藥是長期困擾NSCLC 臨床治療的瓶頸問題。化療后的獲得性化療耐藥是導(dǎo)致患者死亡的最主要的原因［19］。我們利用NSCLC 細(xì)胞株A549 誘導(dǎo)建立了順鉑耐藥株A549/DDP。通過檢測(cè)不同化療藥物的IC50，我們發(fā)現(xiàn)A549/DDP具有MDR特征。與前人報(bào)道的一旦肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥就很難進(jìn)行有效治療的現(xiàn)象一致［20］。

利用本實(shí)驗(yàn)室分離得到的小分子化合物SME 處理細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)SME 對(duì)A549 和A549/DDP 2 種細(xì)胞的IC50很接近，提示SME不僅對(duì)A549有抑制作用，同時(shí)也對(duì)其耐藥細(xì)胞A549/DDP 有抑制作用。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是觀察腫瘤細(xì)胞增殖的另一指標(biāo)。與SME 抑制A549/DDP 細(xì)胞生長現(xiàn)象一致，我們發(fā)現(xiàn)SME可有效抑制A549/DDP的克隆形成。遷移能力是腫瘤細(xì)胞的惡性特征之一?；熀竽[瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移能力提高并發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因［21］。我們發(fā)現(xiàn)SME 可下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin 和slug 的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 的表達(dá)［22］。這些結(jié)果表明SME 逆轉(zhuǎn)A549/DDP的EMT，抑制A549/DDP的遷移能力。

在化療耐藥機(jī)制中最為重要的是ABC 蛋白家族的上調(diào)。ABC 蛋白作為細(xì)胞膜上的離子泵，可將化療藥物泵出癌細(xì)胞，從而導(dǎo)致耐藥［23］。我們通過對(duì)與MDR 密切相關(guān)的ABC 家族蛋白進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)SME 可 抑 制ABCG2 蛋 白。多 項(xiàng) 研 究［24］表 明，ABCG2水平的升高會(huì)導(dǎo)致順鉑耐藥和患者預(yù)后不良。抑制肺癌干細(xì)胞中的ABCG2 水平可增強(qiáng)肺癌干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［25］。我們的研究發(fā)現(xiàn)ABCG2 在A549/DDP 細(xì)胞中表達(dá)增加，提示ABCG2 可能是A549/DDP 發(fā)生MDR 的機(jī)制。SME 不僅可明顯降低ABCG2 蛋白水平，也可降低ABCG2的mRNA 水平，提示SME 可能通過抑制ABCG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而減少ABCG2的蛋白表達(dá)。

EGFR 作為腫瘤生長的激酶信號(hào)通路，其突變和過表達(dá)導(dǎo)致的異常激活與NSCLC 的發(fā)生有關(guān)。EGFR-Akt 信號(hào)通路可通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［26］。EGFR-Akt 下游還可以抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的FoxO1。因此PI3K/Akt/FoxO1通路的激活減少了細(xì)胞凋亡并刺激了細(xì)胞增殖并且最終導(dǎo)致癌癥［27］。有報(bào)道表明ABCG2 受PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)控［28］。與上述報(bào)道相一致，我們的結(jié)果表明，利用Akt的抑制劑deguelin處理細(xì)胞，deguelin和SME協(xié)同抑制p-Akt的同時(shí)也抑制了ABCG2，因此，我們推測(cè)Akt 是ABCG2 的上游。與deguelin 相似，SME 也可有效抑制A549/DDP 中p-Akt 和ABCG2 表達(dá)，并升高FoxO1蛋白水平，表明SME 可抑制Akt 信號(hào)通路。進(jìn)一步研究表明SME 可降低EGF 激發(fā)的p-EGFR 蛋白水平。提示SME可通過抑制順鉑耐藥細(xì)胞中EGFR-Akt信號(hào)通路進(jìn)而抑制下游ABCG2 蛋白表達(dá)，同時(shí)增加凋亡誘導(dǎo)蛋白FoxO1。

最后，我們通過腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)證明了SME 的抗腫瘤活性。SME 不僅可誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯，TUNEL 實(shí)驗(yàn)和凋亡蛋白的檢測(cè)均表明SME還可以誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)了能抑制順鉑耐藥的新化合物SME，并闡明其作用機(jī)制。即SME 通過抑制EGFR 活性，一方面抑制EGFR-Akt-ABCG2 信號(hào)通路，下調(diào)ABCG2 蛋白水平，抑制腫瘤細(xì)胞耐藥；另一方面激活FoxO1，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯和細(xì)胞凋亡；最終達(dá)到抑制NSCLC順鉑耐藥的目的。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

廖雅慧、劉麗云參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)操作；廖雅慧、劉麗云、朱泓睿、林厚文參與了論文的寫作和修改；嚴(yán)繼舟、孫凡參與了課題設(shè)計(jì)和論文修改；所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and conducted by LIAO Yahui and LIU Liyun.The manuscript was drafted and revised by LIAO Yahui，LIU Liyun，ZHU Hongrui and LIN Houwen. The project was designed and the manuscript was revised by YAN Jizhou and SUN Fan.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-05-13

·Published online：2022-08-28

參·考·文·獻(xiàn)

[1] WILD C P, WEIDERPASS E, STEWART B W. World Cancer Report: cancer research for cancer prevention[M]. Lyon: IARC press,2020.

[2] FENNELL D A, SUMMERS Y, CADRANEL J, et al. Cisplatin in the modern era: the backbone of first-line chemotherapy for nonsmall cell lung cancer[J]. Cancer Treat Rev,2016,44:42-50.

[3] MILLER K D, SIEGEL R L, LIN C C, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016[J]. CA A Cancer J Clin, 2016, 66(4):271-289.

[4] ROSSI A, DI MAIO M. Platinum-based chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: optimal number of treatment cycles[J].Expert Rev Anticancer Ther,2016,16(6):653-660.

[5] GOLER-BARON V,ASSARAF Y G. Structure and function of ABCG2-rich extracellular vesicles mediating multidrug resistance[J]. PLoS One,2011,6(1):e16007.

[6] GONEN N,ASSARAF Y G. Antifolates in cancer therapy:structure,activity and mechanisms of drug resistance[J]. Drug Resist Updat,2012,15(4):183-210.

[7] STEWART D J. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer[J].J Natl Cancer Inst,2014,106(1):djt356.

[8] MAHMOUD N,SAEED M E M,SUGIMOTO Y,et al. Cytotoxicity of nimbolide towards multidrug-resistant tumor cells and hypersensitivityviacellular metabolic modulation[J]. Oncotarget,2018,9(87):35762-35779.

[9] FUKUDA Y, SCHUETZ J D. ABC transporters and their role in nucleoside and nucleotide drug resistance[J]. Biochem Pharmacol,2012,83(8):1073-1083.

[10] LI W, ZHANG H, ASSARAF Y G, et al. Overcoming ABC transporter-mediated multidrug resistance: molecular mechanisms and novel therapeutic drug strategies[J]. Drug Resist Updat, 2016,27:14-29.

[11] LIU L Z, ZHOU X D, QIAN G S, et al. AKT1 amplification regulates cisplatin resistance in human lung cancer cells through the mammalian target of rapamycin/p70S6K1 pathway[J]. Cancer Res,2007,67(13):6325-6332.

[12] LI J, GU B B, SUN F, et al. Sesquiterpene quinones/hydroquinones from the marine spongeSpongia pertusaesper[J]. J Nat Prod, 2017,80(5):1436-1445.

[13] AOKI S, KONG D X, MATSUI K, et al. Smenospongine, a spongean sesquiterpene aminoquinone, induces erythroid differentiation in K562 cells[J]. Anticancer Drugs, 2004, 15(4):363-369.

[14] KONG D X, AOKI S, SOWA Y, et al. Smenospongine, a sesquiterpene aminoquinone from a marine sponge, induces G1 arrest or apoptosis in different leukemia cells[J]. Mar Drugs, 2008,6(3):480-488.

[15] KONG D X, YAMORI T, KOBAYASHI M, et al. Antiproliferative and antiangiogenic activities of smenospongine, a marine sponge sesquiterpene aminoquinone[J]. Mar Drugs,2011,9(2):154-161.

[16] PARK S, HWANG I H, KIM J, et al. Smenospongidine suppresses the proliferation of multiple myeloma cells by promoting CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein-mediated β-catenin degradation[J]. Arch Pharm Res,2017,40(5):592-600.

[17] TANG J, WU W, YANG F, et al. Marine sponge-derived smenospongine preferentially eliminates breast cancer stem-like cellsviap38/AMPKα pathways[J]. Cancer Med,2018,7(8):3965-3976.

[18] HIRSCH G E, PARISI M M, MARTINS L A M, et al. γ-Oryzanol reduces caveolin-1 and PCGEM1 expression, markers of aggressiveness in prostate cancer cell lines[J]. Prostate, 2015, 75(8):783-797.

[19] MORO M, CAIOLA E, GANZINELLI M, et al. Metformin enhances cisplatin-induced apoptosis and prevents resistance to cisplatin in co-mutated KRAS/LKB1 NSCLC[J]. J Thorac Oncol,2018,13(11):1692-1704.

[20] LOU J S,YAN L,BI C W,et al. Yu Ping Feng San reverses cisplatininduced multi-drug resistance in lung cancer cellsviaregulating drug transporters and p62/TRAF6 signalling[J]. Sci Rep,2016,6:31926.

[21] WANG G F, BAI X S, JIANG G Q, et al. GIT1 overexpression promotes epithelial-mesenchymal transition and predicts poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Bioengineered, 2021,12(1):30-43.

[22] YOUSEFI M, BAHRAMI T, SALMANINEJAD A, et al. Lung cancer-associated brain metastasis: molecular mechanisms and therapeutic options[J]. Cell Oncol(Dordr),2017,40(5):419-441.

[23] GOTTESMAN M M,PASTAN I H. The role of multidrug resistance efflux pumps in cancer: revisiting a JNCI publication exploring expression of the MDR1 (P-glycoprotein) gene[J]. J Natl Cancer Inst,2015,107(9):djv222.

[24] KIM S,LEE M,DHANASEKARAN D N,et al. Activation of LXRα/β by cholesterol in malignant ascites promotes chemoresistance in ovarian cancer[J]. BMC Cancer,2018,18(1):1232.

[25] LIM Y C, KANG H J, MOON J H. C-Met pathway promotes selfrenewal and tumorigenecity of head and neck squamous cell carcinoma stem-like cell[J]. Oral Oncol,2014,50(7):633-639.

[26] LI H, SCHMID-BINDERT G, WANG D, et al. Blocking the PI3K/AKT and MEK/ERK signaling pathways can overcome gefitinibresistance in non-small cell lung cancer cell lines[J]. Adv Med Sci,2011,56(2):275-284.

[27] XU Z W, MEI J, TAN Y. Baicalin attenuates DDP (cisplatin)resistance in lung cancer by downregulating MARK2 and p-Akt[J].Int J Oncol,2017,50(1):93-100.

[28] WANG L, LIN N, LI Y. The PI3K/AKT signaling pathway regulates ABCG2 expression and confers resistance to chemotherapy in human multiple myeloma[J]. Oncol Rep,2019,41(3):1678-1690.