林 川，董文敏，張倩蕓，劉王振祖，梁 琨，王新宏，安 叡*

葛根芩連湯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷配伍規(guī)律研究

林 川1，董文敏2，張倩蕓1，劉王振祖1，梁 琨1，王新宏1，安 叡1*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院，上海 201200

探討葛根芩連湯緩解腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用及其配伍規(guī)律。將Caco-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TNF-α（80 μg/L）組、小檗堿（6.73 μg/mL）組及葛根芩連湯配伍組（全方組、去甘草組、去葛根組、葛根甘草組和黃芩黃連組，18.75 μg/mL）。除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞給予TNF-α預(yù)處理2 h，再給予相應(yīng)藥物處理24 h。MTT檢測(cè)Caco-2細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；比色法檢測(cè)細(xì)胞中總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，）、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，]和血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，）mRNA和蛋白表達(dá)；熒光顯微鏡觀察Nrf2蛋白入核情況。5.0～25.0 μg/mL的含藥培養(yǎng)基和10～80 μg/L的TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。與TNF-α組比較，各給藥組Caco-2細(xì)胞ROS水平顯著降低（＜0.01）；除去葛根組和黃芩黃連組外，其余各組MDA水平顯著降低（＜0.01），GSH水平明顯升高（＜0.01）；除去葛根組外，其余各給藥組基因表達(dá)明顯升高（＜0.01），全方組和去甘草組基因表達(dá)明顯升高（＜0.05、0.01），全方組和葛根甘草組基因表達(dá)明顯升高（＜0.05、0.01）；除黃芩黃連組外，其余各組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；除去葛根組和黃芩黃連組外，其余各組NQO1蛋白水平顯著升高（＜0.05、0.01），Nrf2蛋白入核明顯增加（＜0.05、0.01）。缺少葛根對(duì)葛根芩連湯抑制Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有較大影響。

葛根芩連湯；葛根；配伍規(guī)律；氧化應(yīng)激；結(jié)腸癌細(xì)胞

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，傾向于氧化，中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。葛根芩連湯出自《傷寒論》，為醫(yī)圣張仲景的名方之一。方中葛根為君，以其甘辛而涼，主入陽(yáng)明經(jīng)，外解肌表之邪、內(nèi)清陽(yáng)明之熱，使表解里和；臣以黃芩、黃連苦寒清熱，堅(jiān)陰止利；佐使以甘草甘緩和中，調(diào)和諸藥；四藥合用，外疏內(nèi)清，表里同治。研究表明，葛根芩連湯對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的緩解作用[1-2]。本課題組前期從化學(xué)成分[3]、入血成分[4]、在人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特征[5]、對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）具體亞型酶活性的影響[6]、腸外翻吸收[7-9]、在體腸道灌流吸收及對(duì)急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響[10-11]等方面對(duì)葛根芩連湯的配伍機(jī)制進(jìn)行了大量研究。本研究以人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為刺激因素[12-13]，激活Caco-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，觀察葛根芩連湯及不同配伍組對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響，以及對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞因子和通路的作用，以闡釋葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制及其配伍的合理性，為更全面地揭示該復(fù)方配伍規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥材

葛根、黃芩、黃連和炙甘草飲片均購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為201016、201103、201118、201109，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倪梁紅副教授鑒定分別為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根、唇形科植物黃芩Georgi的干燥根、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

小檗堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)Y18N8S48598）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；MEM培養(yǎng)基（批號(hào)20210706）、青鏈霉素混合液（批號(hào)20211119）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)2021060105）均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)2217479CP）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT（批號(hào)CR2107085）、β-actin抗體（批號(hào)AC2102050A）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)CR2104079）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；TNF-α（批號(hào)021825）購(gòu)自PeproTech公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20201231）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210106）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210105）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)01152120319）、總RNA抽提試劑Trizol（批號(hào)030221211216）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)031519190503）、Triton X-100（批號(hào)120921220118）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，批號(hào)091720210121）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批號(hào)027E1280LB）、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（批號(hào)017E2232BA）購(gòu)自諾唯贊公司；RIPA裂解液（批號(hào)R1001221）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)B1001231）購(gòu)自上海翊圣生物公司；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號(hào)00102781）、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1]抗體（批號(hào)10017852）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號(hào)00083458）購(gòu)自Proteintech公司；濃縮型正常山羊血清（批號(hào)17G04A09）、熒光（Cy3）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)BST16L31C17G32）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）；FlexStation3型多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）；cytoFLEX型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）；BioPhotometer D30型核酸蛋白檢測(cè)儀，Mastercycler pro型梯度PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；StepOnePlus型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；PowerPac Basic型電泳儀及Mini Transblot型濕轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；AI 600型超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE公司）；BX53型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 葛根芩連湯的制備

設(shè)置全方（GQ）組、去甘草（WGC）組（葛根、黃芩、黃連）、去葛根（WG）組（黃芩、黃連、甘草）、葛根甘草（GG）組、黃芩黃連（QL）組，將葛根、黃芩、黃連、甘草按照5∶3∶2∶2的比例混合（各組中缺味藥材按0計(jì)算），分別加10倍量水，葛根先煎20 min，余藥共煎30 min，煎煮2次，濾過(guò)，合并濾液，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定成分及含量[1,3]，GQ組、WGC組和GG組葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.86、3.78和3.14 mg/g，GQ組、WGC組、WG組和QL組小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.76、0.73、6.91和1.79 mg/g。濾液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，放至室溫后于?20 ℃冰箱預(yù)凍，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)，真空冷凍干燥，取出并碾壓得到凍干粉。以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解凍干粉[14]，經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)，使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞用含20% FBS和1%青鏈霉素混合液的MEM培養(yǎng)基[15-16]，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組、GQ組、WGC組、WG組、GG組和QL組，各給藥組分別以5.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的相應(yīng)藥物處理24 h，對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝給藥/對(duì)照

2.4 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組和TNF-α組，TNF-α組分別以10、20、40、80、100 μg/L的TNF-α處理26 h，對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定各組值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種至6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組、TNF-α組、小檗堿組和葛根芩連湯及其配伍組，TNF-α組給予80 μg/L TNF-α處理26 h，各給藥組給予80 μg/L TNF-α預(yù)處理2 h后，BBR組給予6.73 μg/mL小檗堿[2,17]，葛根芩連湯及其配伍組分別給予18.75 μg/mL藥液[2]，與TNF-α共同作用24 h，對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.6 細(xì)胞T-SOD活性和MDA、GSH水平的檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)T-SOD活性和MDA、GSH水平。

2.7 qRT-PCR檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌。按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析[17]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

2.8 Western blotting檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌。加入100 μL含1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入Loading buffer混勻，95 ℃加熱使蛋白變性，分裝后于?80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，分別加入Nrf2（1∶2000）、NQO1（1∶10 000）、HO-1（1∶1000）和β-actin（1∶3000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗（1∶3000），室溫孵育2 h，顯影后，用Image J軟件分析目的條帶灰度值[18]。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) Nrf2F: GACAATGAGGTTTCTTCGGCTACG R: GGAGAGGATGCTGCTGAAGGAATC NQO1F: CGCAGACCTTGTGATATTCCAG R: CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG HO-1F: CAGCATGCCCCAGGATTTG R: AGCTGGATGTTGAGCAGGA β-actinF: CCTGACTGACTACCTCATGAAG R: GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA

2.9 免疫熒光染色檢測(cè)Caco-2細(xì)胞Nrf2入核作用

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，接種于細(xì)胞爬片上，按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥，24 h后吸棄培養(yǎng)板中液體，加入PBS洗滌，于4%多聚甲醛中固定，加入0.5% Triton X-100室溫通透，滴加正常山羊血清，室溫封閉。吸干封閉液，滴加Nrf2抗體（1∶50），放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜。浸洗，吸干，滴加熒光（Cy3）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶100），于37 ℃濕盒中孵育1 h。滴加DAPI，避光孵育染核。洗滌，吸干液體，加入含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察，采集圖像，使用IPP 6.0軟件對(duì)免疫熒光照片進(jìn)行分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

如表2所示，葛根芩連湯及其配伍在5.0～25.0 μg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率基本在80%及以上，說(shuō)明Caco-2細(xì)胞未受到明顯影響。根據(jù)前期研究，GQ為18.75 μg/mL時(shí)[2]，對(duì)Caco-2細(xì)胞損傷緩解作用較好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中葛根芩連湯及其配伍組的質(zhì)量濃度設(shè)定為18.75 μg/mL。

3.2 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

如表3所示，Caco-2細(xì)胞給予10～80 μg/L的TNF-α處理時(shí)，細(xì)胞存活率均大于80%，活性基本未見明顯影響。根據(jù)前期研究[2]，80 μg/L TNF-α顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，）mRNA的表達(dá)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇80 μg/L TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

3.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

如表4所示，與對(duì)照組比較，TNF-α誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高（＜0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后，Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著降低（＜0.01）；與GQ組比較，WG組和QL組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（＜0.01）。

組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/%組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/% GQ5.091.29±1.49GG5.0110.36±1.07 12.592.65±0.85 12.5103.39±0.82 25.079.76±0.53 25.090.46±1.22 50.060.08±0.51 50.074.03±1.74 100.048.23±0.53 100.043.23±0.48 200.09.62±0.03 200.013.20±1.09 WGC5.094.79±0.33QL5.095.21±1.17 12.597.92±1.04 12.595.83±1.06 25.080.59±1.36 25.079.74±1.43 50.067.43±0.55 50.058.20±0.30 100.048.02±0.71 100.033.20±0.43 200.08.41±0.05 200.09.37±0.03 WG5.094.65±2.28 12.583.99±1.71 25.080.42±0.32 50.064.47±0.44 100.048.34±0.82 200.09.46±0.17

表3 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

表4 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(, n = 3)

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與TNF-α組比較：#＜0.05##＜0.01；與GQ組比較：&＜0.05&&＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01TNF-α group;&< 0.05&&< 0.01GQ group, same as below tables

3.4 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響

如表5所示，與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞中MDA水平顯著升高（＜0.01），T-SOD活性和GSH水平顯著降低（＜0.01）；與對(duì)照組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組MDA水平顯著降低（＜0.01），GSH水平顯著升高（＜0.01）；與GQ組比較，WG組和QL組MDA水平顯著升高（＜0.01），GSH水平顯著降低（＜0.01）。

3.5 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

如表6所示，與對(duì)照組比較，TNF-α組mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，和mRNA表達(dá)水平均明顯降低（＜0.01）；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組、GG組和QL組mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），GQ組和WGC組mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），GQ組和GG組mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與GQ組比較，WGC組、WG組、GG組和QL組和mRNA表達(dá)水平均明顯降低（＜0.01），WGC組、WG組和QL組mRNA表達(dá)水平均明顯降低（＜0.01）。

表5 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞中T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響(, n = 3)

表6 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

3.6 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖1和表7所示，與對(duì)照組比較，TNF-α組NQO1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.01）；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組、WG組和GG組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組NQO1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與GQ組比較，QL組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01）。

圖1 各組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)情況

3.7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Nrf2蛋白入核影響

如圖2和表8所示，與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈下降趨勢(shì)；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加（＜0.05、0.01）。

表7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖2 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白入核情況 (×400)

表8 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá) (, n = 3)

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯可上調(diào)Nrf2信號(hào)通路緩解TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理?yè)p傷[1-2]。本課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步探討了葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)組方中缺少君藥葛根或僅有臣藥黃芩和黃連對(duì)減輕氧化應(yīng)激損傷作用有較大影響[1]。因此，本研究以TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)一步探討葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律。

TNF-α可以激活炎癥反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生大量增加[19-20]。ROS的增加會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化，進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞毒性。MDA為ROS與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[21]，其含量可以間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯及不同配伍組均可以顯著降低TNF-α引起的ROS含量增加，但去葛根組和黃芩黃連組降低ROS含量的作用比全方組弱且有顯著性差異。去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MDA含量增加無(wú)明顯降低作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中，去葛根組對(duì)大鼠血清中MDA含量的降低明顯弱于全方組。表明全方中君藥葛根對(duì)于降低過(guò)氧化物含量起重要作用。

SOD可以清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化陰離子和自由基[22]，GSH可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能免受過(guò)氧化氫的氧化損傷[23]。SOD活性和GSH水平降低會(huì)導(dǎo)致自由基堆積[24]。本研究結(jié)構(gòu)顯示，給予藥物干預(yù)后，TNF-α引起的T-SOD活性和GSH水平下降得到了改善，但去甘草組和去葛根組T-SOD活性與對(duì)照組相比具有顯著性差異，去葛根組和黃芩黃連組對(duì)GSH的作用明顯低于全方組。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中，去葛根組大鼠血清中T-SOD活性明顯低于對(duì)照組，黃芩黃連組GSH活性與全方組相比具有顯著性差異，與本研究結(jié)果基本一致。提示葛根芩連湯能夠促進(jìn)抗氧化酶活性，其中君藥葛根的作用較大。

Nrf2是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子，Nrf2的激活可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡[12,23-24]。NQO1同時(shí)也是輔酶Q（泛醌）和維生素E的還原酶，可通過(guò)維持輔酶Q和維生素E的還原狀態(tài)來(lái)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[1-2]。HO-1是血紅素生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子的限速酶[22-23]。NQO1和HO-1是體內(nèi)重要的II相解毒酶和抗氧化劑，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯及配伍對(duì)TNF-α引起的、和mRNA和蛋白表達(dá)降低均有一定的恢復(fù)作用。其中對(duì)mRNA的促進(jìn)作用，其他配伍組均弱于全方組，黃芩黃連組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)明顯低于全方組，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[1]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究藥物對(duì)Nrf2蛋白入核的影響，發(fā)現(xiàn)去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α導(dǎo)致的Nrf2蛋白入核減少?zèng)]有明顯改變。上述結(jié)果證實(shí)缺少葛根的配伍組激活Nrf2信號(hào)通路作用較弱。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，葛根素、黃芩苷、小檗堿和甘草苷均具有一定的抑制作用，其中葛根素和小檗堿的抗氧化應(yīng)激作用相對(duì)較好[2]。本研究以小檗堿為陽(yáng)性對(duì)照藥物，質(zhì)量濃度為6.73 μg/mL，但去葛根組和黃芩黃連組中所含小檗堿僅有0.13和0.03 μg/mL，因此去葛根組和黃芩黃連組盡管含小檗堿成分，由于含量低導(dǎo)致其抗氧化應(yīng)激作用與全方組相比有明顯差異，同時(shí)這2個(gè)配伍組又不含有葛根素，這也是抗氧化應(yīng)激作用弱的又一原因。

以上研究結(jié)果表明，葛根芩連湯及不同配伍對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷均有一定的抑制作用。綜合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]結(jié)果，方中缺少君藥葛根對(duì)抗氧化應(yīng)激作用有明顯影響。然而葛根芩連湯抑制氧化應(yīng)激損傷的配伍規(guī)律及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還有待通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題組將進(jìn)一步展開葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激損傷的有效成分研究，深入探討葛根芩連湯配伍規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Combination rule of Gegen Qinlian Decoction on inhibiting oxidative damage stimulated by TNF-α in Caco-2 cells

LIN Chuan1, DONG Wen-min2, ZHANG Qian-yun1, LIU Wang-zhenzu1, LIANG Kun1, WANG Xin-hong1, AN Rui1

1. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Pudong Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201200, China

To investigate the effect of Gegen Qinlian Decoction (葛根芩連湯) on relieving tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced oxidative stress injury in human colon cancer Caco-2 cells and its compatibility.Caco-2 cells were randomly divided into control group, TNF-α (80 μg/L) group, berberine (6.73 μg/mL) group and Gegen Qinlian Decoction compatibility group [Gegen Qinlian group (GD), Gancao (et) absent group (WGC), Gegen () absent group (WG),-etgroup (GG), Huangqin ()-Huanglian () group (QL), 18.75 μg/mL]. Except for the control group, cells in other groups were pretreated with TNF-α for 2 h, and then treated with corresponding drugs for 24 h. Caco-2 cell viability was detected by MTT; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry; Total superoxide dismutase (T-SOD) activity and malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels were detected by colorimetry; qRT-PCR and Western blotting were used to detect nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), NAD(P)H quinine oxidoreductase 1 (NQO1) and heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA and protein expressions; Fluorescence microscope was used to observe nuclear penetration of Nrf2 protein.5.0—25.0 μg/mL drug-containing medium and 10—80 μg/L TNF-α had no significant effect on the viability of Caco-2 cells. Compared with TNF-α group, ROS level in Caco-2 cells of each administration group were significantly decreased (< 0.01). Except for WG group and QL group, MDA level in the other groups were significantly decreased (< 0.01), and GSH level was significantly decreased (< 0.01).gene expression was significantly increased in all drug-administered groups except WG group (< 0.01), andgene expression was significantly increased in GD group and WGC group (< 0.05, 0.01),gene expression was significantly increased in GD group and GG group (< 0.05, 0.01). Except for QL group, protein expressions of Nrf2 and HO-1 in other groups were significantly increased (< 0.01); Except for WG group and QL group, NQO1 protein expression was significantly increased in the other groups (< 0.05, 0.01), and Nrf2 protein into the nucleus was significantly increased (< 0.05, 0.01).The lack ofhas a negative effect on the inhibition of oxidative stress injury of Caco-2 cells by Gegen Qinlian Decoction.

Gegen Qinlian Decoction;; compatibility of medicines; oxidative stress; colon cancer cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6492 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.021

2022-07-15

上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（19ZR1451900）

林 川，男，碩士研究生，從事藥物分析與體內(nèi)過(guò)程研究。Tel: 19821726781 E-mail: 3325892608@qq.com

安 叡，女，博士，教授，從事藥物分析與體內(nèi)過(guò)程研究。Tel: (021)51322183 E-mail: anruimw@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]