李存玉，林亞娟，李明明，章 蓮，李 碩，彭國平，支興蕾*

基于存在狀態(tài)定量計算模型研究丹參注射液的醇沉精制機(jī)制

李存玉1, 2, 3，林亞娟4，李明明5，章 蓮1，李 碩1，彭國平1, 2, 3，支興蕾1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023 4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，江蘇 南京 210023 5. 江蘇神龍藥業(yè)有限公司，江蘇 東臺 224200

基于成分存在狀態(tài)定量計算模型，分析丹參注射液（Danshen Injection，DI）的醇沉工藝中酚酸類成分的傳遞規(guī)律。以DI中水溶性酚酸類成分丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B為檢測指標(biāo)，基于納濾傳質(zhì)數(shù)學(xué)模型，收集膜通量、截留率數(shù)據(jù)，擬合溶質(zhì)傳質(zhì)系數(shù)，以分子態(tài)單體成分為參照，構(gòu)建成分存在狀態(tài)定量計算模型，進(jìn)而分析中間體密度1.05、1.15、1.25 g/mL時，指標(biāo)性成分醇沉至75%、85%的轉(zhuǎn)移率與成分存在狀態(tài)及相對分子質(zhì)量的相關(guān)性，以期解明醇沉精制機(jī)制。存在狀態(tài)定量計算冪函數(shù)方程的相關(guān)性系數(shù)均大于0.99，DI中間體的密度為1.05～1.25 g/mL時，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B分子態(tài)比例分別為1.14%～5.25%、66.70%～80.25%、10.51%～19.11%、1.13%～11.44%，對密度-分子態(tài)比例-醇沉轉(zhuǎn)移率進(jìn)行相關(guān)性分析，醇沉體積分?jǐn)?shù)由75%增加至85%，轉(zhuǎn)移率下降比例排序?yàn)榈⑺剽c＞丹酚酸B＞迷迭香酸＞原兒茶醛，成分存在狀態(tài)為影響醇沉轉(zhuǎn)移率的主導(dǎo)因素，且與成分相對分子質(zhì)量存在一定相關(guān)性。構(gòu)建了DI中間體中酚酸類成分分子狀態(tài)定量計算方法，初步闡明醇沉精制機(jī)制，有助于制劑醇沉工藝的標(biāo)準(zhǔn)化控制。

存在狀態(tài)；丹參；丹參注射液；醇沉；丹參素鈉；原兒茶醛；迷迭香酸；丹酚酸B；納濾；冪函數(shù)方程

中藥制藥過程工藝參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化控制有利于提升制劑質(zhì)量的均一性[1-2]，2015年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布中藥標(biāo)準(zhǔn)化行動，旨在促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)提升標(biāo)準(zhǔn)化水平，切實(shí)提高中藥產(chǎn)品質(zhì)量。醇沉是中藥制劑生產(chǎn)中常用的精制技術(shù)，根據(jù)成分溶解度的差異去除雜質(zhì)，保留有效成分。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，通過數(shù)字化控制乙醇加入速度、溶液攪拌轉(zhuǎn)速保障制劑批次間的一致性，但是醇沉引起質(zhì)量均一性的差異仍是制藥行業(yè)難以解決的技術(shù)難題[3-5]。

中藥成分的溶解度與存在狀態(tài)直接相關(guān)，以離子態(tài)、締合態(tài)、復(fù)合態(tài)等形式存在的中藥成分，在醇沉過程中損失明顯。在明確有效成分存在狀態(tài)的前提下，精準(zhǔn)化調(diào)節(jié)醇沉參數(shù)，將有助于提升制劑質(zhì)量的均一性。目前，用于分析成分結(jié)構(gòu)的紅外光譜、掃描電鏡、差示熱分析等分析技術(shù)難以獲取原溶液環(huán)境下的成分真實(shí)存在狀態(tài)[6-8]。納濾截留相對分子質(zhì)量為100～1000，以電荷、孔道位阻為主要分離效應(yīng)，適用于荷電中藥成分的常溫化精制，前期研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)存在狀態(tài)決定納濾分離行為，且分離過程中傳質(zhì)系數(shù)與溶質(zhì)質(zhì)量濃度呈冪值相關(guān)[9]，基于成分存在狀態(tài)與限域環(huán)境傳質(zhì)行為的相關(guān)性，構(gòu)建存在狀態(tài)定量計算模型，探索中藥制劑醇沉工藝機(jī)制。丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B是丹參注射液（Danshen Injection，DI）中的指標(biāo)性成分，相對分子質(zhì)量、pKa呈現(xiàn)出一定的梯度性，且醇沉過程中的轉(zhuǎn)移率存在明顯差異，參考DI制法中醇沉環(huán)節(jié)“丹參提取液密度1.15～1.28 g/mL時，分別醇沉至含醇量為75%、85%”的工藝參數(shù)，以4種成分丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B為考察指標(biāo)，分析“密度-成分狀態(tài)-成分轉(zhuǎn)移率”的相關(guān)性，以期為探索中藥制劑醇沉技術(shù)的內(nèi)在作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，VWD檢測器，美國Agilent公司；10-13型密度計，規(guī)格1.0～1.3 g/L，衡水耀華器械儀表廠；TNZ-1型納濾分離設(shè)備、Fog-machine型中壓泵，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；Buchi R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；MS105型十萬分之一電子天平、AL204型萬分之一電子天平，瑞士Mettler Toledo集團(tuán)；PB-10 pH計，德國Sartorius公司；NDJ-5S型黏度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Millipore Direct-Q5型純水/超純水一體機(jī)，美國Millipore公司。

1.2 材料

1812型復(fù)合聚酰胺納濾膜，截留相對分子質(zhì)量800，星達(dá)（泰州）膜科技有限公司；丹參飲片（批號180201）購自安徽省金芙蓉中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)輝教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參Bge.的干燥根和根莖；對照品丹參素鈉（批號110855-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.8%）、原兒茶醛（批號110810-201007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）、迷迭香酸（批號111871-201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%）、丹酚酸B（批號111562-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；提取物丹參素鈉（批號FY1784，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、原兒茶醛（批號FY1784，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、迷迭香酸（批號FY1143，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）和丹酚酸B（批號FY1167，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%），均購自南通飛宇生物科技有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸為色譜純；乙醇、鹽酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 DI中間體 參照DI制法，取丹參9.0 kg加水煎煮3次，第1次2 h，第2、3次各1.5 h，合并煎液，濾液減壓濃縮至所考察的密度，即得。

2.1.2 混合對照品溶液 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B對照品適量，置于5 mL棕色量瓶中，加10%甲醇溶液制成含丹參素鈉0.420 mg/mL、原兒茶醛0.152 mg/mL、迷迭香酸0.196 mg/mL和丹酚酸B 1.105 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 提取物溶液 參照不同密度時DI中間體中指標(biāo)性成分質(zhì)量濃度和黏度，分別精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B提取物，超純水超聲溶解，加入蔗糖調(diào)節(jié)溶液黏度，即得4種成分的提取物溶液。

2.2 樣品檢測

2.2.1 色譜條件 Agilent 1260型高效液相色譜儀；Thermo Scientific C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，10%～20%乙腈；10～40 min，20%～45%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm。色譜圖見圖1。

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL置于5 mL棕色量瓶中，10%甲醇稀釋至刻度，高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)（），指標(biāo)性成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：丹參素鈉＝1119＋517.67，2＝0.999 2；原兒茶醛＝1 420.1－459.4，2＝0.999 5；迷迭香酸＝5252＋4 551.3，2＝0.999 2；丹酚酸B＝2 204.7－8 596.4，2＝0.999 6；結(jié)果表明丹參素鈉在8.4～168.0 μg/mL、原兒茶醛在3.04～60.80 μg/mL、迷迭香酸在3.92～78.40 μg/mL、丹酚酸B在22.1～442.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

1-丹參素鈉 2-原兒茶醛 3-迷迭香酸 4-丹酚酸B

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，色譜峰峰面積積分值的RSD分別為丹參素鈉1.06%、原兒茶醛0.61%、迷迭香酸0.86%、丹酚酸B 0.72%。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按“2.1.1”項(xiàng)下方法處理的DI中間體溶液10 μL，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，色譜峰峰面積積分值的RSD分別為丹參素鈉1.10%、原兒茶醛0.96%、迷迭香酸1.02%、丹酚酸B 1.65%，結(jié)果表明DI中間體在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備5份DI中間體溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，各成分質(zhì)量濃度的RSD分別為丹參素鈉1.52%、原兒茶醛1.16%、迷迭香酸1.44%、丹酚酸B 2.05%。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取DI中間體溶液6份，分別精密加入混合對照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行定量測定，計算得平均回收率分別為丹參素鈉101.06%、原兒茶醛102.50%、迷迭香酸98.85%、丹酚酸B 97.21%，其RSD分別為1.64%、1.32%、1.95%、2.18%。

2.3 密度對成分轉(zhuǎn)移率的影響

為了探索密度對醇沉過程中指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率的影響規(guī)律，取DI中間體，分別采用減壓濃縮（80 ℃）至密度1.05、1.15、1.25 g/mL，分別醇沉至含醇量為75%、85%，靜置12 h，取上清液檢測并分析丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的轉(zhuǎn)移率。

轉(zhuǎn)移率＝上清上清/(原原)

上清、原分別為醇沉上清液和原液中指標(biāo)性成分質(zhì)量濃度，上清、原分別為醇沉上清液和原液體積

醇沉至含醇量75%和85%時，指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率見表1。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和DI中間體密度的升高，丹參中4種酚酸類成分的轉(zhuǎn)移率表現(xiàn)為原兒茶醛＞迷迭香酸＞丹酚酸B＞丹參素鈉。根據(jù)指標(biāo)性成分的解離常數(shù)（原兒茶醛7.56＞迷迭香酸4.01＞丹參素鈉3.82＞丹酚酸B 2.77），相對分子質(zhì)量（丹酚酸B＞迷迭香酸＞丹參素鈉＞原兒茶醛），結(jié)合DI中間體溶液pH 4.85～5.16，其中原兒茶醛主要以分子態(tài)形式存在，丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B主要以離子態(tài)形式存在，醇沉引起的成分轉(zhuǎn)移率變化存在狀態(tài)均的相關(guān)性表現(xiàn)出離子態(tài)轉(zhuǎn)移率低于分子態(tài)，且與相對分子質(zhì)量存在相關(guān)性。

表1 DI中間體密度對醇沉工藝中酚酸類成分轉(zhuǎn)移率的影響

Table 1 Effect ofDI intermediatedensity on transfer rate of phenolic acids in alcohol precipitation process

密度/(g·mL?1)75%醇沉轉(zhuǎn)移率/%85%醇沉轉(zhuǎn)移率/% 丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸丹酚酸B丹參素鈉原兒茶醛迷迭香酸丹酚酸B 1.0572.2594.4186.7673.5046.2390.7577.1652.08 1.1553.8891.0581.9067.7139.8186.7068.8747.62 1.2542.3081.6174.2756.2727.0672.2556.2231.60

2.4 存在狀態(tài)的定量擬合

將1812型復(fù)合聚酰胺納濾膜裝入納濾分離設(shè)備中，通過管路依次連接中壓泵、壓力表、納濾分離設(shè)備、截留閥。取DI中間體0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液采用超純水稀釋2、4、8倍，根據(jù)成分的一級解離常數(shù)pKa（丹參素鈉3.82、原兒茶醛7.56、丹酚酸B 2.77，迷迭香酸4.01[10]），調(diào)節(jié)單體成分溶液pH低于pKa 2個酸度值，使得成分分子態(tài)比例≥99%。分別將提取物溶液置于儲液罐中，通過管路連接儲液罐和納濾液端，并進(jìn)行納濾分離，調(diào)節(jié)中壓泵轉(zhuǎn)速和截留閥，控制跨膜壓力差為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 MPa，收集相應(yīng)溶質(zhì)質(zhì)量濃度和跨膜壓力差下的膜通量（v），待儲液罐中溶質(zhì)質(zhì)量濃度相對穩(wěn)定時，取樣平衡液并收集納濾液，HPLC檢測平衡液及納濾液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1）計算截留率（o）。

o＝1－納濾/平衡（1）

根據(jù)溶質(zhì)傳質(zhì)系數(shù)（）與o、v的相關(guān)性，擬合ln[(1－o)v/o]與的線性方程[11]，如式（2）所示。收集并計算溶質(zhì)初始質(zhì)量濃度（0）下的、o、v，根據(jù)式（3）擬合與0的冪函數(shù)方程。

ln[(1－o)v/o]＝ln(/)＋v/（2）

1/為斜率，ln(/)為截距，為膜傳質(zhì)性能常數(shù)，為膜厚度

＝0（3）

為相關(guān)系數(shù)，為冪值

以單體成分構(gòu)建的分子態(tài)溶質(zhì)質(zhì)量濃度與傳質(zhì)系數(shù)的冪函數(shù)方程為參照，對系列密度的DI中間體進(jìn)行納濾分離，擬合與0的冪函數(shù)方程。對比單體成分與DI中間體相同值時，根據(jù)式（3）計算中間體目標(biāo)成分相較于單體成分分離環(huán)境下的質(zhì)量濃度（丹），根據(jù)式（4）計算成分分子態(tài)比例。

分子態(tài)比例＝1－丹/0（4）

2.4.1 丹參素鈉的分子態(tài)定量擬合 如圖2所示，在密度為1.05 g/mL時，丹參素鈉單體及提取物的ln[(1－o)v/o]和v線性關(guān)系良好，相關(guān)性系數(shù)均大于0.98，其中單體成分的相關(guān)性數(shù)據(jù)點(diǎn)中，質(zhì)量濃度為48.60 μg/mL相對分散，在丹參素鈉的單一溶液中，溶質(zhì)質(zhì)量濃度對傳質(zhì)系數(shù)影響強(qiáng)于中間體。根據(jù)計算得到的傳質(zhì)系數(shù)，擬合與溶質(zhì)質(zhì)量濃度的冪函數(shù)方程，結(jié)果見表2，相關(guān)性系數(shù)均大于0.99，丹參素鈉以分子態(tài)形式存在的比例為5.25%。

如圖3所示，密度升高至1.15 g/mL，丹參素鈉質(zhì)量濃度對傳質(zhì)系數(shù)的影響程度下降，單體成分的ln[(1－o)v/o]和v相關(guān)性數(shù)據(jù)更為集中，丹參素鈉及中間體的ln[(1－o)v/o]和v線性關(guān)系、質(zhì)量濃度與傳質(zhì)系數(shù)的冪函數(shù)方程，結(jié)果見表3，相關(guān)性系數(shù)均大于0.99。計算得到丹參素鈉在DI中間體中分子態(tài)比例為1.40%。

圖2 密度1.05 g?mL?1時丹參素鈉ln[(1－Ro)Jv/Ro]對JV的相關(guān)性

表2 密度1.05 g?mL?1時丹參素鈉傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 2 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of sodium danshensu at density of 1.05 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 48.6016.0510.20k＝10.509 0 C00.109 5k＝5.039 1 C00.181 25.25 24.3014.539.01R2＝0.998 2R2＝0.997 8 12.6512.977.90 6.8311.837.18

圖3 密度1.15 g?mL?1時丹參素鈉ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表3 密度1.15 g?mL?1時丹參素鈉傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 3 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of sodium danshensu at density of 1.15 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 79.2011.349.48k＝9.465 4 C00.041 9k＝7.384 4 C00.057 71.40 39.6011.109.14R2＝0.990 8R2＝0.995 4 19.8010.708.81 9.9010.428.40

密度升高至1.25 g/mL，ln[(1－o)v/o]和v線性方程成立（圖4），相關(guān)性系數(shù)均大于0.98，且溶質(zhì)質(zhì)量濃度與傳質(zhì)系數(shù)的冪函數(shù)方程的相關(guān)性系數(shù)也均大于0.99，丹參素鈉以分子態(tài)形式存在的比例為1.14%，結(jié)果見表4。

隨著DI中間體密度由1.05 g/mL升高至1.25 g/mL，同時存在丹酚酸類成分的氧化分解，丹參素鈉的質(zhì)量濃度也隨之升高48.6～126.6 μg/mL，以分子態(tài)形式存在的比例為5.25%～1.14%，結(jié)合表1中醇沉引起的轉(zhuǎn)移率變化，以離子態(tài)、締合態(tài)等形式存在的丹參素鈉隨著乙醇質(zhì)量濃度的增加，溶解度下降，引起轉(zhuǎn)移率下降。

2.4.2 原兒茶醛的分子態(tài)定量擬合 如圖5所示，在密度為1.05 g/mL時，原兒茶醛在醇沉過程中的轉(zhuǎn)移率優(yōu)于其他3種指標(biāo)性成分，與其存在狀態(tài)和相對分子質(zhì)量等因素相關(guān)，結(jié)果見表5；在DI中間體密度為1.05 g/mL時，ln[(1－o)v/o]和v線性關(guān)系良好（2＞0.98）。相較于原兒茶醛單體溶液，在不同溶質(zhì)質(zhì)量濃度環(huán)境下，中間體納濾分離時的傳質(zhì)系數(shù)擬合數(shù)據(jù)相似。從表5中可以看出，中間體中原兒茶醛傳質(zhì)系數(shù)變化程度低于單體溶液。結(jié)合表1中原兒茶醛醇沉轉(zhuǎn)移率均大于90%，說明以分子態(tài)（80.25%）形式存在的原兒茶醛易溶于高體積分?jǐn)?shù)乙醇中，且相對分子質(zhì)量低不易被醇沉物包裹。

隨著密度增加至1.15 g/mL，丹參酚酸類成分因熱處理水解，引起原兒茶醛質(zhì)量濃度的升高，在進(jìn)行l(wèi)n[(1－o)v/o]和v線性擬合時，原兒茶醛在單體及中間體溶液中表現(xiàn)出相似的分離行為（圖6），且傳質(zhì)系數(shù)也相對接近（表6），在傳質(zhì)系數(shù)線性方程和冪函數(shù)方程均成立的前提下（2＞0.98），醇沉至75%及85%時，原兒茶醛轉(zhuǎn)移率下降均低于5%，且此時分子態(tài)比例為78.50%，說明原兒茶醛在醇沉過程中轉(zhuǎn)移率與其分子態(tài)比例息息相關(guān)。

圖4 密度1.25 g?mL?1時丹參素鈉ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表4 密度1.25 g?mL?1時丹參素鈉傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 4 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of sodium danshensu at density of 1.25 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 126.606.635.52k＝5.445 0 C00.040 6k＝3.286 2 C00.106 71.14 63.306.445.07R2＝0.999 7R2＝0.990 5 31.656.274.81 15.836.094.39

圖5 密度1.05 g?mL?1時原兒茶醛ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表5 密度1.05 g?mL?1時原兒茶醛傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 5 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of protocatechuic aldehyde at density of 1.05 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 18.4216.0815.27k＝8.948 5 C00.206 1k＝11.847 C00.086 180.25 9.2114.3314.25R2＝0.991 2R2＝0.996 1 4.6112.4713.57 2.3010.4612.72

在密度為1.25 g/mL的溶液環(huán)境下，原兒茶醛單體溶液的ln[(1－o)v/o]和V相關(guān)性數(shù)據(jù)點(diǎn)較中間體分散（圖7），但相關(guān)性系數(shù)均大于0.98。隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度的升高，傳質(zhì)系數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，符合限域空間的溶解-擴(kuò)散理論[12]，結(jié)果見表7。以單體成分為參照，擬合出中間體中原兒茶醛的分子態(tài)比例為66.70%。

DI中間體密度由1.05 g/mL升高至1.25 g/mL，分子態(tài)形式存在原兒茶醛比例為80.25%～66.70%，結(jié)合表1中醇沉轉(zhuǎn)移率變化規(guī)律，原兒茶醛的醇沉機(jī)制是以相對分子質(zhì)量為前提，分子狀態(tài)為主導(dǎo)的精制過程。

圖6 密度1.15 g?mL?1時原兒茶醛ln[(1－Ro)Jv/Ro]對JV的相關(guān)性

表6 密度1.15 g?mL?1時原兒茶醛傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 6 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of protocatechuic aldehyde at density of 1.15 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 30.5412.3611.72k＝6.874 0 C00.171 7k＝8.837 0 C00.080 978.50 15.2710.9310.95R2＝0.998 1R2＝0.992 6 7.649.8410.37 3.828.619.90

圖7 密度1.25 g?mL?1時原兒茶醛ln[(1－Ro)Jv/Ro]對JV的相關(guān)性

表7 密度1.25 g?mL?1時原兒茶醛傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 7 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of protocatechuic aldehyde at density of 1.25 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 73.208.488.18k＝4.179 7 C00.167 7k＝4.586 4 C00.133 466.70 36.607.747.35R2＝0.990 2R2＝0.997 3 18.306.906.76 9.155.986.18

2.4.3 迷迭香酸的分子態(tài)定量擬合 結(jié)果見圖8，密度為1.05 g/mL的迷迭香酸單體和DI中間體，進(jìn)行l(wèi)n[(1－o)v/o]和v進(jìn)行線性擬合，相關(guān)性系數(shù)均大于0.98。對比圖8中的散點(diǎn)分布特征，中間體較單體成分相對分散，在相同黏度環(huán)境下，中間體溶液的膜通量明顯偏低。以迷迭香酸單體溶液為參照，擬合溶質(zhì)質(zhì)量濃度與傳質(zhì)系數(shù)的冪函數(shù)方程，結(jié)果見表8，相關(guān)性系數(shù)均大于0.99，DI中間體在質(zhì)量濃度為0.580 mg/mL時，迷迭香酸以分子態(tài)形式存在的比例為19.11%。

密度增加至1.15 g/mL，膜通量均呈現(xiàn)下降趨勢，ln[(1－o)v/o]和v相關(guān)性系數(shù)均大于0.95（圖9），DI中間體在密度1.15 g/mL時，迷迭香酸在不同質(zhì)量濃度下的相關(guān)性數(shù)據(jù)點(diǎn)存在一定差異，從表9中也可看出，隨著中間體溶液的稀釋，迷迭香酸的傳質(zhì)系數(shù)相對穩(wěn)定。迷迭香酸在中間體質(zhì)量濃度為0.63 mg/mL時，迷迭香酸以分子態(tài)形式存在的比例為14.60%。

在密度為1.25 g/mL的溶液環(huán)境下，在濃差極化效應(yīng)的作用下，迷迭香酸單體及DI中間體的膜通量和跨膜壓力差的線性關(guān)系降低（圖10），膜通量進(jìn)一步的下降，但ln[(1－o)v/o]和v相關(guān)性系數(shù)均大于0.92，且傳質(zhì)系數(shù)與溶質(zhì)質(zhì)量濃度的冪函數(shù)方程均成立（表10），以分子態(tài)形式存在的迷迭香酸比例為10.51%。

對表1中醇沉過程中迷迭香酸的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行相關(guān)性分析，隨著DI中間體密度的增加，迷迭香酸分子態(tài)比例為19.11%～10.51%，分子態(tài)比例的降低，75%醇沉轉(zhuǎn)移率由86.76%下降至74.27%，85%醇沉轉(zhuǎn)移率由77.16%下降至56.22%。

圖8 密度1.05 g?mL?1時迷迭香酸ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表8 密度1.05 g?mL?1時迷迭香酸傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 8 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of rosmarinic acid at density of 1.05 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 0.58026.8820.33k＝29.570 0 C00.167 6k＝21.171 0 C00.068 719.11 0.29024.3919.57R2＝0.992 3R2＝0.994 8 0.14521.0518.48 0.07319.0517.64

圖9 密度1.15 g?mL?1時迷迭香酸ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表9 密度1.15 g?mL?1時迷迭香酸傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 9 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of rosmarinic acid at density of 1.15 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 0.6316.2914.84k＝16.627 0 C00.046 2k＝15.043 0 C00.027 414.60 0.3215.7214.60R2＝0.996 6R2＝0.997 5 0.1615.3114.29 0.0814.7714.03

圖10 密度1.25 g?mL?1時迷迭香酸ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表10 密度1.25 g?mL?1時迷迭香酸傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 10 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of rosmarinic acid at density of 1.25 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 0.728.767.44k＝8.986 0 C00.078 1k＝7.523 0 C00.033 310.51 0.368.317.26R2＝0.998 6R2＝0.993 3 0.187.837.13 0.097.466.93

2.4.4 丹酚酸B的分子態(tài)定量擬合 結(jié)果見圖11，對密度為1.05 g/mL溶液環(huán)境下的丹酚酸B ln[(1－o)v/o]和v進(jìn)行線性關(guān)系計算，相關(guān)性系數(shù)均大于0.98，從圖11中可以看出，單體較中間體溶液的數(shù)據(jù)點(diǎn)分散，說明質(zhì)量濃度對丹酚酸B單體的傳質(zhì)系數(shù)影響相對明顯。以丹酚酸B單體溶液為參照，擬合溶質(zhì)質(zhì)量濃度與傳質(zhì)系數(shù)的冪函數(shù)方程，結(jié)果見表11，DI中間體中以分子態(tài)形式存在的丹酚酸B比例為11.44%，此時在75%及85%醇沉的轉(zhuǎn)移率分別為73.5%、52.08%。

圖11 密度1.05 g?mL?1時丹酚酸B ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表11 密度1.05 g?mL?1時丹酚酸B傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 11 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of salvianolic acid Bat density of 1.05 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 2.0813.6210.41k＝12.399 0 C00.142 7k＝9.668 0 C00.093 211.44 1.0412.669.63R2＝0.992 3R2＝0.994 9 0.5211.319.08 0.2610.178.56

隨著溶液密度由1.05 g/mL增加至1.15 g/mL時，丹酚酸B單體及中間體溶液的線性方程及冪函數(shù)方程均成立（2＞0.98），結(jié)果見圖12。且DI中間體中丹酚酸B的分子態(tài)比例為9.43%，相對穩(wěn)定（表12）。相應(yīng)的醇沉中的轉(zhuǎn)移率變化也均小于6%，說明密度增加，丹酚酸B分子態(tài)比例出現(xiàn)輕微下降，也引起了醇沉過程中轉(zhuǎn)移率的相應(yīng)下降。

DI中間體的密度增加至1.25 g/mL時，丹酚酸B單體及中間體溶液的線性方程及冪函數(shù)方程均成立（2＞0.98），結(jié)果見圖13。丹酚酸B的分子態(tài)比例由11.44%下降至1.13%（表13）。在DI中間體的濃縮過程中，因熱處理丹酚酸B轉(zhuǎn)化為原兒茶醛、丹參素鈉等成分[13]，引起質(zhì)量濃度下降，會減輕醇沉帶來的成分損失。但相較于密度1.05 g/mL，丹酚酸B在75%和85%醇沉的轉(zhuǎn)移率下降均超過17%，說明丹酚酸B分子態(tài)比例下降改變其在醇沉液中的溶解度，促進(jìn)了不溶物對丹酚酸B的吸附和包裹，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率明顯下降。

圖12 密度1.15 g?mL?1時丹酚酸B ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表12 密度1.15 g?mL?1時丹酚酸B傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 12 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of salvianolic acid B at density of 1.15 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 1.369.758.46k＝9.580 0 C00.063 3k＝8.219 0 C00.090 69.43 0.689.377.92R2＝0.998 7R2＝0.999 7 0.348.967.46 0.178.557.00

圖13 密度1.25 g?mL?1時丹酚酸B ln[(1－Ro)Jv/Ro]對Jv的相關(guān)性

表13 密度1.25 g?mL?1時丹酚酸B傳質(zhì)系數(shù)、冪函數(shù)方程及分子態(tài)比例

Table 13 Mass transfer coefficient, power function equation and molecular state percent of salvianolic acid B at density of 1.25 g?mL?1

質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)傳質(zhì)系數(shù)/(×10?6m·s?1)冪函數(shù)方程分子態(tài)比例/% 單一成分中間體單一成分中間體 0.745.433.44k＝5.594 0 C00.098 3k＝3.544 0 C00.118 31.13 0.375.093.11R2＝0.997 5R2＝0.991 3 0.194.712.93 0.094.442.67

根據(jù)DI中間體中4種指標(biāo)成分“密度-分子態(tài)比例-醇沉轉(zhuǎn)移率”的相關(guān)性，醇沉濃度由75%增加至85%，按照轉(zhuǎn)移率下降比例，丹參素鈉＞丹酚酸B＞迷迭香酸＞原兒茶醛，與分子態(tài)比例直接相關(guān)，呈現(xiàn)出分子態(tài)比例下降，醇沉轉(zhuǎn)移率下降的規(guī)律，說明存在狀態(tài)為影響生產(chǎn)工序間成分傳遞規(guī)律的主導(dǎo)因素。其次，在分子態(tài)比例相對接近的迷迭香酸和丹酚酸B中，醇沉轉(zhuǎn)移率迷迭香酸＞丹酚酸B，中間體中迷迭香酸增加，丹酚酸B下降，但丹酚酸B醇沉損失更為明顯，說明在相對分子質(zhì)量偏低的迷迭香酸在醇沉液中溶解度更高，可以減輕醇沉損失。在密度為1.25 g/mL時，DI中間體溶液中丹參素鈉和丹酚酸B分子態(tài)比例接近，隨著醇質(zhì)量濃度增加至85%，丹參素鈉轉(zhuǎn)移率同比下降36.03%，丹酚酸B下降43.80%，因此在醇沉過程中，成分存在狀態(tài)主導(dǎo)醇沉轉(zhuǎn)移率。

3 討論

臨床上DI常用于治療冠心病、心絞痛，其中丹參中的酚酸類成分為主要藥效成分[14]，在丹參提取、濃縮過程中，丹酚酸類成分因熱處理分解成丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸，中間體中成分含量也隨之升高。在納濾分離不同密度下的中間體溶液時，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸的傳質(zhì)系數(shù)并未隨著質(zhì)量濃度升高而增加，表現(xiàn)出與溶解-擴(kuò)散分離模型不相符的分離現(xiàn)象。而隨著DI中間體的密度增加，膜通量明顯下降直接改變了溶質(zhì)的傳質(zhì)行為，引起傳質(zhì)系數(shù)下降。同時，上述3種成分的截留率也呈下降趨勢，溶質(zhì)的傳質(zhì)行為符合納濾溶解-擴(kuò)散分離模型。

醇沉是中藥制藥精制的常用技術(shù)手段[15]，在生產(chǎn)過程中通過調(diào)節(jié)制劑中間體的密度、溫度、pH等參數(shù)控制指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率的差異[16-18]，而與轉(zhuǎn)移率息息相關(guān)的成分存在狀態(tài)，因缺少檢測分析手段，無法真正意義上實(shí)現(xiàn)醇沉過程的標(biāo)準(zhǔn)化控制，引起生產(chǎn)批次間質(zhì)量的差異性。本實(shí)驗(yàn)基于納濾傳質(zhì)數(shù)學(xué)模型，圍繞“密度-成分狀態(tài)-成分轉(zhuǎn)移率”的相關(guān)性，為中藥酚酸類成分醇沉前溶液中存在狀態(tài)定量計算方法提供了研究策略，為中藥制藥醇沉參數(shù)的精準(zhǔn)化控制提供技術(shù)支撐，從而提升制劑質(zhì)量的均一性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Alcohol-precipitation mechanism of Danshen Injection based on molecular state quantitative calculation model

LI Cun-yu1, 2, 3, LIN Ya-juan4, LI Ming-ming5, ZHANG Lian1, LI Shuo1, PENG Guo-ping1, 2, 3, ZHI Xing-lei1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Province Engineering Research Center of Classical Prescription, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China 4. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 5. Jiangsu Shenlong Pharmaceutical Co., Ltd., Dongtai 224200, China

To explore the transfer rules of phenolic acids in the alcohol precipitation process of Danshen Injection (DI) based on molecular state quantitative calculation model.In the experiment, sodium danshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinic acid and salvianolic acid B were selected as indexes for exploring the alcohol-precipitation mechanism. Based on the mathematical model of nanofiltration mass transfer, membrane flux and rejection were collected to calculate the solute mass transfer coefficients, and the quantitative calculation model of molecular state was established with molecular monomer components as reference of DI. Furthermore, the correlation among the transfer rate, molecular state and molecular weight was analyzed with the densities of 1.05, 1.15, 1.25 g/mL of concentrated solution under the alcohol precipitation of 75% and 85%.The power function equation of molecular state quantitative calculation was set up successfully with the regression coefficients (2> 0.99), as the density of intermediate in DI was 1.05—1.25 g/mL, the molecular proportions of sodium danshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinic acid and salvianolic acid B were 1.14%—5.25%, 66.70%—80.25%, 10.51%—19.11% and 1.13%—11.44%, respectively. The correlation analysis of “density- molecular state ratio- alcohol precipitation transfer rate” showed that alcohol precipitation concentration increased from 75% to 85%, and the decreasing rate of transfer rate was in the order of sodium danshensu > salvianolic acid B > rosmarinic acid > protocatechualdehyde. Therefore, the molecular state of phenolic acids was the main factor which affected the transfer rate of alcohol precipitation, and the relative molecular weight was correlated with the transfer rate.The quantitative calculation method of molecular state was established for phenolic acids in the intermediate of DI, and the refining mechanism of alcohol precipitation was preliminarily expounded which was helpful for standardized control of preparation alcohol precipitation process.

molecular state;et; Danshen Injection; alcohol-precipitation; sodium danshensu; protocatechuic aldehyde; rosmarinic acid; salvianolic acid B; nanofiltration; power function equation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6431 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.015

2022-05-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82274106）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20211303）；江蘇省333高層次人才培養(yǎng)工程；2021年度康緣中藥學(xué)院創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（kyxysc06）；2022年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（103152022105）

李存玉（1985—），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟し蛛x原理及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。Tel: (025)86798186 E-mail: 300632@njucm.edu.cn

支興蕾（1981—），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥皂苷類超濾分離機(jī)制研究。Tel: (025)86798186 E-mail: 300040@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]