李 棟， 項(xiàng) 坤， 常 苗， 鐘佳伶， 何佳萌， 茆燦泉

(1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都610031； 2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院， 成都610072)

病原微生物耐藥性是臨床治療面臨的巨大挑戰(zhàn)，多藥耐藥微生物(Multidrug resistant microbes，MDR)增加感染者的發(fā)病率和死亡率，并對(duì)包括ICU病房、接受手術(shù)、移植或癌癥治療在內(nèi)各種人群的臨床療效產(chǎn)生不良影響[1]。全世界每年約有70萬(wàn)人死于MDR感染，如果不努力應(yīng)對(duì)或開(kāi)發(fā)新的抗生素，到2050年這一數(shù)字將達(dá)到1 000萬(wàn)人[2]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)具有很強(qiáng)的毒性和抗生素耐藥性，可傳播和感染動(dòng)物和人類(lèi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]，對(duì)人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重威脅[4]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)替代藥物或新抗生素來(lái)應(yīng)對(duì)微生物感染的挑戰(zhàn)，尤其是由耐藥菌引起的感染。藥用植物是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要資源寶庫(kù)，含有多種活性成分的各種藥用植物及組方具有毒副作用相對(duì)較小、不易產(chǎn)生耐藥性等多種優(yōu)勢(shì)[5]。研究以MRSA為主要研究對(duì)象，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室近5年開(kāi)展的大量植物藥抗菌篩選研究成果的積累，對(duì)科學(xué)設(shè)計(jì)的組方MZL-1(黃芩、冰片、大黃等多種植物合理配比)進(jìn)行抗MRSA的藥效作用及分子機(jī)制研究，旨在為抗MRSA等耐藥病原菌以及微生物感染提供一種潛在有效的植物藥組方制品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

電導(dǎo)率儀DDSJ-318(上海雷磁)；掃描電子顯微鏡Inspect(美國(guó)FEI)；流式細(xì)胞儀BD Accuri C6 Plus(美國(guó)BD公司)；96T堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC / PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；MZL-1試制品(黃芩、冰片、大黃等植物藥材組方的75%醇提物)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC 25923)為西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)臨床株(No.230071)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)獲自四川省人民醫(yī)院和四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。植物藥材購(gòu)自成都市荷花池藥材市場(chǎng)，并經(jīng)生藥學(xué)專(zhuān)家鑒定確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 MRSA抑菌率測(cè)定

取500 μL MZL-1藥液加入10.0 μL MRSA菌懸液，處理至4個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)(2、5、10、20 min)時(shí)，分別加入500 μL PBS，充分混勻，各取50.0 μL混合液平板涂布，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以無(wú)菌生理鹽水替代MZL-1作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照x=(a-b)/a×100%計(jì)算抑制率，其中，x為抑菌率，a為對(duì)照組菌落數(shù)，b為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)。若抑菌率處于50%～90%，則產(chǎn)品有抑菌作用；若抑菌率≥90%，產(chǎn)品有較強(qiáng)的抑菌作用。

1.2.2 多種微生物的MIC測(cè)定

采用試管稀釋法測(cè)定MZL-1對(duì)多種微生物的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)，細(xì)菌和真菌分別使用LB和SDA培養(yǎng)基。用液體培養(yǎng)基按2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%的不同梯度稀釋MZL-1至總體積5.0 mL，未加藥組作為對(duì)照組。每組接入50.0 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液，混勻，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)6 h(真菌培養(yǎng)于30 ℃，180 r/min，12 h)。每管取出50.0 μL進(jìn)行平板涂布，37 ℃培養(yǎng)12 h(真菌30 ℃培養(yǎng)48 h)，菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以出現(xiàn)單菌落數(shù)最少的最大含量為組方的MIC。

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率及堿性磷酸酶活性測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRSA菌懸液(1.0×107CFU/mL)以8 000 r/min離心5 min，然后用5%的葡萄糖洗滌菌體沉淀，直到其電能接近5%葡萄糖，作為等滲菌液。將1×MIC和2×MIC含量的MZL-1添加到5%的葡萄糖中，測(cè)量電導(dǎo)率記為L(zhǎng)1。將1×MIC和2×MIC含量的MZL-1加入等滲菌液中，完全混合后，37 ℃孵育。在0、1、3、5、7、9 h時(shí)測(cè)量混合液電導(dǎo)率記為L(zhǎng)2。在沸水中處理5%葡萄糖細(xì)菌混合液的電導(dǎo)率作為對(duì)照，記為L(zhǎng)0。MZL-1的相對(duì)電導(dǎo)率表示為L(zhǎng)=100%×(L2-L1)/L0。

對(duì)菌液堿性磷酸酶測(cè)定，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MRSA菌懸液(1.0×107CFU/mL)用1×MIC和2×MIC含量的MZL-1處理，無(wú)菌水作對(duì)照。將混合物分別在37 ℃下孵育，在0、1、2、3、5、7 h時(shí)取出，8 000 r/min離心5 min，使用堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定上清液中的堿性磷酸酶含量。每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.4 SEM掃描電鏡觀(guān)察

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MRSA菌懸液在37 ℃、200 r/min條件下用 MZL-1(1/2×MIC, 1×MIC)處理6 h，未加藥的菌液作為對(duì)照。離心收集沉淀，用PBS洗滌2次，用40 g/L的蔗糖溶液洗滌一次，時(shí)間均為5 min，用系列梯度酒精脫水，30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每梯度10 min。加入100%酒精重懸后，吸取少量懸液滴加在玻片上，將玻片輕輕粘在導(dǎo)電膠上，臨界點(diǎn)干燥，真空噴鍍。最后，在掃描電子顯微鏡下觀(guān)察細(xì)菌顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 凋亡周期的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MRSA細(xì)胞用PBS洗滌3次，將菌液的OD600調(diào)節(jié)至1.0。菌液稀釋100倍后在37 ℃、200 r/min下用 MZL-1(1/2×MIC, 1×MIC)處理6 h，未加藥的菌液作為對(duì)照。按照Annexin V-FITC / PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行染色。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行分析，每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞。最后使用FlowJo V10.0.7分析結(jié)果。

1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

(1)有效化學(xué)成分篩選。從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)(TCMSP，https:∥tcmspw.com/tcmsp.php)或文獻(xiàn)中篩選黃芩、冰片、大黃等MZL-1主要藥材的化學(xué)成分，篩選藥物相似度(DL)≥0.18的候選化合物。

(2)潛在基因作用靶點(diǎn)的確定。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得MZL-1中所有化合物的基因靶點(diǎn)，然后篩選出144種候選化合物所對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)，即為MZL-1的潛在基因作用靶點(diǎn)。

(3)與微生物感染相關(guān)的差異基因篩選。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索“Microbial infection”關(guān)鍵詞，重點(diǎn)關(guān)注“Genome-wide”“bacterial”“fungal”和“infection”，尋找微生物感染患者的差異基因樣本。篩選樣本中P<0.05且|log2(fold change)| >0.5的基因被認(rèn)為是和微生物感染顯著差異表達(dá)相關(guān)基因。

(4)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。將MZL-1的潛在基因作用靶點(diǎn)與微生物感染相關(guān)差異基因取交集得到的23個(gè)基因于STRING(https:∥www.string-db.org/, Version: 11.0)網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白互作分析，物種設(shè)為智人，蛋白質(zhì)之間相互作用基于已有數(shù)據(jù)，互作得分設(shè)為最高置信度0.400，下載TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction network,PPI)并進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

(5)生物信息學(xué)分析。用Bioconductor中“DOSE”“clusterProfiler”和“enrichplot”3個(gè)安裝包，并使用R語(yǔ)言編程，進(jìn)行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，選擇前20個(gè)富集的通路以氣泡圖來(lái)呈現(xiàn)。使用Cytoscape構(gòu)建KEGG通路與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MZL-1對(duì)MRSA及多種微生物的廣譜抑菌作用

MRSA抑菌性能結(jié)果顯示，MZL-1處理組2、5、10、20 min均未有菌落產(chǎn)生，而對(duì)照組則有生長(zhǎng)正常的菌落，且在2 min時(shí)即完全抑制，5～20 min均表現(xiàn)出100%的抑菌效果[圖1(a)]。MZL-1對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC為10.0%，對(duì)MRSA的MIC為7.5%，揭示MZL-1的抑菌作用不受細(xì)菌耐藥性的影響，甚至對(duì)耐藥株還有更強(qiáng)的抑制作用。另外，對(duì)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和藤黃微球菌的MIC顯示，組方MZL-1同樣表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制作用[圖1(b)]。

(a)MZL-1對(duì)MRSA的抑菌性能；(b)不同菌株MIC值。圖1 MZL-1對(duì)MRSA的抑菌性能和多種微生物的MIC測(cè)定Figure 1 The antimicrobial activities of MZL-1 against MRSA and the determination of MIC for various microorganisms

2.2 MZL-1處理對(duì)MRSA細(xì)胞完整性的影響

相較對(duì)照組，MZL-1處理組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高，并且呈現(xiàn)含量依賴(lài)性[圖2(a)]。與相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)果相似，加藥組的堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組，同樣表現(xiàn)出加藥初始就高表達(dá)的特點(diǎn)[圖2(b)]。隨著時(shí)間變化，堿性磷酸酶的活性也呈小幅變化，同時(shí)也表現(xiàn)出含量依賴(lài)性。

掃描電鏡觀(guān)察不同濃度MZL-1處理后的MRSA菌體，與空白組相比，加藥組MRSA細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，部分細(xì)胞凹陷破裂，細(xì)胞大小不一，細(xì)胞表面不再光滑且彼此黏附，細(xì)胞間出現(xiàn)很多可能是細(xì)胞碎片的雜質(zhì)，隨著含量增高，黏附現(xiàn)象加劇[圖2(c)]。

(a)相對(duì)電導(dǎo)率；(b)堿性磷酸酶活性；(c)掃描電鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。圖2 MZL-1對(duì)MRSA細(xì)胞完整性的影響Figure 2 The effects of MZL-1 on the integrity of MRSA cells

2.3 MZL-1對(duì)MRSA的促凋亡作用

細(xì)胞凋亡是一種生理性的程序性細(xì)胞死亡，受到基因的嚴(yán)格控制。圖3所示，隨著MZL-1處理含量的增加，MRSA活細(xì)胞率(Q4)從98%降到4.35%。相反，經(jīng)MZL-1處理6 h后，凋亡的細(xì)胞比率(Q3+Q2)從1.94%增加到95.6%，特別注意的是，早期凋亡的細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)一個(gè)很大的占比，這也印證了相對(duì)電導(dǎo)率和堿性磷酸酶的結(jié)果，即在體外試驗(yàn)中MZL-1對(duì)MRSA的抑制作用是高效的。

Q4為活細(xì)胞；Q3為早期凋亡細(xì)胞；Q2為晚期凋亡細(xì)胞；Q1為壞死細(xì)胞。圖3 不同含量MZL-1處理對(duì)MRSA細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effects of different contents of MZL-1 on MRSA apoptosis

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 MZL-1中活性成分的篩選與抗微生物感染差異基因表達(dá)分析

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中共獲得146種符合條件的化合物。其中，黃芩72種，大黃63種，冰片5種，其他6種，去除冗余，共計(jì)144種。144種化合物對(duì)應(yīng)916個(gè)潛在基因作用靶點(diǎn)，黃芩649個(gè)，大黃187個(gè)，冰片6個(gè)，其他74個(gè)。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)找到GSE65088這一系列的微生物感染差異基因表達(dá)樣本，分析正常樣本和感染后樣本共得到1 100個(gè)差異基因，選取前20個(gè)顯著上調(diào)和前20個(gè)顯著下調(diào)的基因繪制熱圖(圖4)。其中C為正常樣本，計(jì)21例；T為不同微生物感染樣本，計(jì)36例，依次為6例煙曲霉菌、10例白色念珠菌、10例大腸桿菌、10例金黃色葡萄球菌。正常樣本和感染樣本的差異主要涉及HERC5、ISG15、CXCL10、CCL8、TNF、LOC730249、IRG1、IL6、RSAD2和IFI44L等基因。

(a)21個(gè)正常樣本；(b)煙曲霉菌；(c)白色念珠菌；(d)大腸桿菌；(e)金黃色葡萄球菌。紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)；顏色越鮮明表示差異越顯著。圖4 微生物感染差異基因熱圖Figure 4 Heat map of differential genes in various microbial infections

將916個(gè)潛在基因作用靶點(diǎn)與微生物感染的差異基因取交集得到29個(gè)化合物和23個(gè)靶基因。根據(jù)相關(guān)性排序，芹菜素(MOL000008)、黃芩素(MOL002714)、漢黃芩素(MOL000173)、大黃素(MOL000472)這些化合物能結(jié)合的靶點(diǎn)都在5個(gè)及以上，推測(cè)上述化合物可能是MZL-1抗微生物感染的關(guān)鍵成分。RXRA、RELA、CDKN1A這3個(gè)基因所涉及的化合物超過(guò)5個(gè)，推測(cè)上述基因可能是MZL-1抗微生物感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖5)。

中間矩形代表靶基因；周?chē)鷻E圓代表化合物。紅色矩形代表核心靶基因；綠色橢圓代表核心化合物。圖5 化合物與靶基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Compound and target gene relationship network

2.4.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件分析，共得到22個(gè)節(jié)點(diǎn)，119條邊。以節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)Degree值大小，邊的粗細(xì)反映節(jié)點(diǎn)之間相互作用強(qiáng)度“Combinedscore”(圖6)。其中IL6、FOS、JUN、MMP9、VEGFA、STAT3和RELA等靶點(diǎn)排名靠前，推測(cè)可能為MZL-1的重要作用靶點(diǎn)。

圖6 MZL-1與候選靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 6 PPI network of MZL-1 and candidate targets

2.4.3 GO和KEGG富集分析

對(duì)23個(gè)靶基因進(jìn)行包括生物過(guò)程(BP，biological process)、細(xì)胞成分(CC，cellular component)和分子功能(MF，molecular function)的GO分析。結(jié)果顯示，共有873個(gè)GO功能被顯著富集。其中生物過(guò)程中833個(gè)，分子功能中34個(gè)，細(xì)胞成分中6個(gè)。生物學(xué)過(guò)程主要與脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)等相關(guān)[圖7(a)]；分子功能主要集中在與細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子活性以及受體配體活性等有關(guān)方面[圖7(b)]；細(xì)胞組分主要涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物以及核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等[圖7(c)]。

KEGG富集分析共有94條通路，前20條分別為卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Th17細(xì)胞分化、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、美國(guó)錐蟲(chóng)病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、麻疹、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、HIF-1信號(hào)通路、炎性腸病(IBD)、耶爾森氏菌感染、松弛素信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、利什曼病、人T細(xì)胞白血病病毒1感染[圖7(d)]?？梢?jiàn)很多通路與微生物感染、炎癥有關(guān)。

(a)GO生物過(guò)程；(b)GO分子功能；(c)GO細(xì)胞組分；(d)KEGG富集分析。圖7 GO和KEGG富集分析Figure 7 GO and KEGG enrichment analysis

2.4.4 KEGG網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)顯著富集通路和調(diào)控這些通路的基因之間的相關(guān)性，構(gòu)建基因通路網(wǎng)絡(luò)(圖8)。方格代表目標(biāo)基因，V形圖代表網(wǎng)絡(luò)中的通路，圖形面積越大代表相關(guān)性越強(qiáng)。從圖 8可以看出，RELA是核心靶基因，F(xiàn)OS、JUN、NFKBIA、IL6、IL1B等基因也很重要，它們可能是MZL-1抗微生物感染的關(guān)鍵靶基因。

圖8 KEGG基因通路網(wǎng)絡(luò)Figure 8 KEGG gene pathway network

3 討論與結(jié)論

為尋找抗微生物耐藥的新方法，以MRSA為研究對(duì)象，在課題組前期植物藥抗菌篩選研究的基礎(chǔ)上，選取黃芩、冰片、大黃等多種植物藥合理配比并組方為MZL-1。黃芩含有豐富的黃酮成分，具有廣譜抑菌、抗炎能力[6]，有研究表明，黃芩中的黃芩苷可以抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，協(xié)同藥物更容易殺傷細(xì)菌[7]；冰片用于治療傷口愈合、治療燒傷、喉嚨痛和皮膚感染[8]，還可通過(guò)抑制氧化損傷、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)對(duì)全腦缺血再灌注損傷模型具有顯著保護(hù)作用[9]；大黃素是中藥大黃的重要單體，能抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、保護(hù)肝腎、利尿、治療胰腺炎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、降低血液黏度、抗腫瘤等，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[10-11]。抑菌性能評(píng)估結(jié)果表明：MZL-1對(duì)MRSA具有強(qiáng)的抑制作用，抑制效果甚至強(qiáng)于金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株，這個(gè)結(jié)果非常有意義，揭示MZL-1組方具有不受抗生素耐藥性影響的優(yōu)勢(shì)。深入研究發(fā)現(xiàn)，MZL-1對(duì)白念珠菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、藤黃微球菌等多種微生物均有強(qiáng)抑制作用，這為MZL-1抗MRSA及廣譜抗菌產(chǎn)品的研發(fā)帶來(lái)了很大希望。

細(xì)菌細(xì)胞膜是離子和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要滲透屏障[12]，它被破壞會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏[13]。堿性磷酸酶存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞壁被破壞時(shí)，堿性磷酸酶將從細(xì)胞中泄漏出來(lái)[14]，菌液中電解質(zhì)含量和堿性磷酸酶活性可以很好地表征細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整程度。菌液相對(duì)電導(dǎo)率、堿性磷酸酶活性的結(jié)果證明MZL-1對(duì)MRSA菌體細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的破壞和胞內(nèi)內(nèi)容物溢出，掃描電鏡的結(jié)果又從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了大量菌體的死亡和破裂，并且均表現(xiàn)出含量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MZL-1處理后活細(xì)胞大量減少，凋亡細(xì)胞增加，且大多出現(xiàn)在早期凋亡階段，這也進(jìn)一步印證電導(dǎo)率、堿性磷酸酶以及掃描電鏡的結(jié)果，即MZL-1對(duì)MRSA抑制作用快速且有效。

最后，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)方法，對(duì)MZL-1的可能分子抗菌機(jī)制進(jìn)行研究。芹菜素、漢黃芩素、黃芩素和大黃素能結(jié)合的微生物感染相關(guān)靶點(diǎn)較多，且它們均具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用[15-16],可能是MZL-1的代表性化合物。將候選靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，發(fā)現(xiàn)IL6、FOS、JUN、MMP9、VEGFA、STAT3、RELA等靶點(diǎn)排名靠前。芹菜素、黃芩素均可以抑制IL6的轉(zhuǎn)錄[17-18]，漢黃芩素在骨關(guān)節(jié)炎治療中可以抑制IL6、MMP9等多種基因的表達(dá)[19]，MZL-1含有的多種黃酮類(lèi)、蒽醌/蒽酮類(lèi)、有機(jī)酸、萜類(lèi)化合物很可能作用于上述靶點(diǎn)。GO富集分析顯示靶基因主要參與細(xì)胞對(duì)小分子反應(yīng)，細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子等過(guò)程。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)所涉及的通路大多與炎癥因子響應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)菌和病毒感染及免疫功能有關(guān)。KEGG網(wǎng)絡(luò)分析最終確定RELA、FOS、JUN、NFKBIA、IL6、IL1B等關(guān)鍵基因。RELA基因?qū)儆贜F-κB家族，NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，是一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的終點(diǎn)，由許多生物過(guò)程(如炎癥、免疫、分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生和凋亡)相關(guān)的大量刺激啟動(dòng)[20-21]。FOS基因家族編碼蛋白可與JUN家族編碼蛋白形成二聚體AP-1，AP-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞凋亡、炎癥響應(yīng)等生物過(guò)程[22-23]。NFKBIA基因編碼NF-Kappa-B抑制劑家族的一個(gè)成員，其所編碼蛋白可以與REL產(chǎn)生二聚體從而調(diào)控炎癥反應(yīng)[24]。IL6和IL1B編碼的細(xì)胞因子都是重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，并廣泛參與到細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種細(xì)胞活動(dòng)中[25-26]。MZL-1具有多成分多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，可以調(diào)節(jié)和響應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)和通路，這也可能是MZL-1對(duì)包括MRSA在內(nèi)的多種微生物有較強(qiáng)抑制效果的原因。

MZL-1不受MRSA耐藥性影響，可以破壞其細(xì)胞完整性而起到抑制作用，同時(shí)MZL-1對(duì)多種微生物均有很強(qiáng)的抑制效果，研究為目前微生物耐藥性的解決提供了一條新的思路。本工作還存在很多不足，植物藥材的質(zhì)量控制以及抑菌和抗耐藥機(jī)制還需要從基因、蛋白方面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。