烏云達來, 美 榮

(內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022)

減數(shù)分裂是將重組基因繼承給子代的一種特殊細(xì)胞分裂，是高等動物形成卵子和精子等配子的途徑。減數(shù)分裂中可觀察到不同于有絲分裂的特殊染色體運動，例如，同源染色體的配對、聯(lián)會及重組。在有絲分裂過程中各同源染色體獨立運動，而在減數(shù)分裂過程中則會發(fā)生同源染色體配對和DNA雙鏈斷裂(double strand breaks, DSBs)介導(dǎo)的重組[1]。同源染色體之間的重組對在減數(shù)第一次分裂中的同源染色體精確分離極為重要。例如，在減數(shù)分裂過程中染色體的不均等分離是唐氏綜合征等染色體三體病的主要發(fā)病原因，對臨床診斷及治療非常重要。

減數(shù)分裂重組由拓?fù)洚悩?gòu)酶II類蛋白SPO11催化而發(fā)生的DSBs所啟動[2-3]。DSBs一旦被核糖核酸酶(nucleases)切割形成游離3′-末端的DNA單鏈，RAD51和DMC1等早期重組中間體被招募到此部位[4]。這些蛋白通常在熒光顯微鏡下主要以小圓點的形狀定位在染色體的未聯(lián)會軸上。在小鼠細(xì)線期細(xì)胞核中RAD51和DMC1的數(shù)目最多約達到每核250小圓點[5]。在嵌入的3′-末端部位開始合成DNA時的結(jié)構(gòu)稱為SEI(single-end invasion intermediate)，此時RAD51和DMC1等早期重組中間體被MSH4等中期重組中間體所取代[6]。之后，在非常穩(wěn)定的SEI狀態(tài)下，DSBs末端的另一方單鏈區(qū)域與開裂部分的單鏈區(qū)域(相補鏈)進行氫鍵結(jié)合(2nd-end capture)，由于從各3′-末端開始合成DNA，最終形成含有2個Holliday結(jié)構(gòu)的中間體dHJ(double-Holliday junction)。此時，MSH4等中期重組中間體被MLH1等晚期重組中間體所取代[7]。MLH1是交叉重組所必需的蛋白，只出現(xiàn)在粗線期染色體的交叉位點，而不會出現(xiàn)在非交叉位點。此時，每核含有約23～27個MLH1小圓點[8]。在DSBs修復(fù)過程中，形成dHJ結(jié)構(gòu)并最終以交叉或非交叉重組的形式被解開[9]。在減數(shù)分裂型重組過程中，除了上述重組中間體蛋白質(zhì)起修復(fù)作用之外，一些非重組中間體蛋白質(zhì)，例如，RAD21L和REC8等粘連蛋白也有著不可或缺的影響。

粘連蛋白是普遍存在于真核生物中的高度保守性蛋白質(zhì)復(fù)合體。哺乳類動物的有絲分裂型(通用性)粘連蛋白復(fù)合體主要由4個亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即2個染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(structural maintenance of chromosome，SMC)家族的SMC1a和SMC3，1個a-kleisin亞基RAD21和1個基質(zhì)蛋白SA1或SA2。減數(shù)分裂型粘連蛋白復(fù)合體不同于有絲分裂型粘連蛋白復(fù)合體，SMC3以外的其他3個亞基均存在減數(shù)分裂同種異型基因產(chǎn)物，針對SMC1a具有SMC1b，SA1或SA2具有SA3，RAD21具有REC8或RAD21L[10-14]。其中，RAD21L只存在于脊椎動物的減數(shù)分裂型a-kleisin亞基。相關(guān)研究表示，REC8不僅對姐妹染色單體的粘連至關(guān)重要，還在減數(shù)第一次分裂前期期間與RAD21L共同貢獻于側(cè)生組分(axial elements, AE)形成與聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemal complex, SC)組裝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15-17]。RAD21L和REC8在減數(shù)第一次分裂前期形成不同的粘連蛋白復(fù)合體，無論在每個染色體上的分布，還是在同源染色體之間的分布均具有獨特之處[13-14,16,18]。在減數(shù)第一次分裂前期，RAD21L與REC8的功能有相同之處，也有其特殊作用，例如，在同源染色體配對的起始、同源染色體的聯(lián)會、DSBs介導(dǎo)的同源染色體重組等減數(shù)分裂特異性染色體運動中均具有重要作用。其中，尤其是兩者在同源染色體重組過程中作用的分子機制仍不清楚。

研究采用小鼠精母細(xì)胞，使用高分辨率顯微鏡(three dimensional structured illumination microcopy，3D-SIM)進行免疫熒光分析，觀察并比較減數(shù)分裂型粘連蛋白RAD21L和REC8與重組中間體RAD51和MSH4之間的定位關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠使用于減數(shù)分裂型粘連蛋白、重組中間體等在染色體上的定位分析。

1.2 抗體

實驗采用的一次抗體：兔抗多克隆RAD21L抗體、小鼠抗多克隆RAD21L抗體、兔抗多克隆REC8抗體[14]、小鼠抗多克隆REC8抗體[19]、兔抗多克隆MSH4抗體 (ab58666)和兔抗多克隆RAD51抗體 (SC-8349, santa cruz biotechnology, dallas, TX)。通過適當(dāng)?shù)腁lexa Fluor 488或者Alexa Fluor 568 (molecular probes, eugene, OR) 檢測抗原-抗體復(fù)合體。

1.3 免疫熒光分析

根據(jù)Heyting和Dietrich[20]描述的方法制備成年小鼠精巢細(xì)胞懸液。將細(xì)胞置于多聚-L-賴氨酸(poly-L-lysin) 包被蓋玻片上，含有2%多聚甲醛 (PFA) 的緩沖液中固定10 min[21]。蓋玻片上的精巢細(xì)胞用0.2% Triton X-100通透5 min，磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 浸洗3次，每次10 min。將細(xì)胞在4 ℃環(huán)境下用封閉液適量稀釋的一次抗體中孵育過夜，PBS浸洗10 min，detergent solution (5 mmol/L EDTA, 0.25% gelatin, 0.05% Triton X-100 in PBS) 浸洗10 min，再用PBS浸洗10 min。下一步將蓋玻片與用封閉液適量稀釋的二次抗體孵育1 h。PBS浸洗10 min，detergent solution浸洗10 min，再用PBS浸洗10 min。接著4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 對DNA進行復(fù)染。用VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 進行封片。最后，用裝有100 ×UPlanSApo NA1.40 油浸物鏡 (Olympus, Tokyo, Japan) 的DeltaVision OMX (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 3D-SIM和持有Plan Apochromat 10× and 100×/1.46 oil DIC物鏡的共聚焦激光掃描顯微鏡 (LSM; Olympus, Lake Success, NY) 觀察采集圖像。所有圖像用DeltaVision Soft Worx軟件處理。一些圖像以Z軸疊加的形式顯示。

1.4 圖像分析

采集的圖像包含整個核的Z形截面圖。對每個核的3D-SIM圖像進行不同蛋白(粘連蛋白與重組中間體)熒光信號的共定位(重疊)分析。實驗使用與對所有圖像保持視覺上恒定的自動閾值“delta”系數(shù)相同的閾值[21]。接著使用此閾值測量Mandars共定位系數(shù)[22]。最后分析α-kleisin和重組中間體熒光信號的鄰近程度的百分率。

1.5 共免疫沉淀法

首先將細(xì)胞抽提液與適量的抗RAD21L或抗REC8抗體孵育，進行旋轉(zhuǎn)攪拌2 h。添加rProtein A Sepharose(GE Healthcare)后繼續(xù)進行旋轉(zhuǎn)攪拌1 h。利用TNE緩沖液沖洗3次得到沉淀物，對其進行SDS-PAGE分析。

1.6 蛋白印跡法

先用10% SDS-PAGE分離精巢細(xì)胞提取液以及免疫沉淀液，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜(Thermo scientific)上。接著用適量的抗RAD21L、抗REC8、抗RAD51、抗MSH4抗體孵育PVDF 轉(zhuǎn)印膜。再用兔 IgG HRP標(biāo)記抗體(GE Healthcare)孵育。最后用ECL Prime Western Blotting Detection(GE Healthcare)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-kleisin和重組中間體的定位特征

RAD21L對減數(shù)分裂過程中同源染色體的重組是必不可少的[23]。為探究RAD21L在重組過程中的作用機制，用抗α-kleisin(RAD21L或REC8)抗體和抗重組中間體(RAD51或MSH4)抗體對小鼠精母細(xì)胞進行免疫熒光標(biāo)記，采用3D-SIM觀察RAD21L與重組中間體之間的定位特征。結(jié)果顯示，RAD21L和REC8的線形熒光信號均出現(xiàn)在同源染色體上[圖1(a)(e)(i)(m)和(q)]，而早期重組中間體RAD51和中期重組中間體MSH4則以小圓點的形式出現(xiàn)在同源染色體之間[圖1(f)(j)(n)和(r)]。其中部分RAD21L的熒光信號橫跨在還未聯(lián)會的同源染色體之間[圖1(d)(h)和(l)]，與其相比REC8并無類似熒光信號[圖1(d)(p)和(t)]。通過進一步觀察RAD21L的橫跨信號與重組中間體之間的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)：RAD21L的橫跨信號往往出現(xiàn)在MSH4和RAD51的鄰近之處[圖1 (h)和(l), 箭頭表示RAD21L的橫跨信號]；而REC8只出現(xiàn)在重組中間體較遠(yuǎn)的邊角之處[圖1(p)和(t),箭頭表示REC8的熒光信號]。由此可推測，RAD21L橫跨信號出現(xiàn)在DSBs周圍的目的可能是在DSBs周圍建立具有一定穩(wěn)定性的空間結(jié)構(gòu)，促使DSBs的精確修復(fù)。

采用小鼠精母細(xì)胞進行免疫熒光染色技術(shù)的3D-SIM圖片。(a)～(c)為采用抗RAD21L抗體(綠)和抗REC8抗體(紅)；(e)～(g)為采用抗RAD21L抗體(綠)和抗RAD51抗體(紅)；(i)～(k)為采用抗RAD21L抗體(綠)和抗MSH4抗體(紅)；(m)～(o)為采用抗REC8抗體(綠)和抗RAD51抗體(紅)；(q)～(s)為采用抗REC8抗體(綠)和抗MSH4抗體(紅)。(d)(h)(l)(p)和(t)為放大圖片。箭頭表示兩種α-kleisin的熒光定位，星號表示重組中間體的熒光定位。主圖像的標(biāo)尺為1 μm，放大圖像的標(biāo)尺為0.5 μm。圖1 小鼠減數(shù)分裂型a-kleisin與重組中間體之間的定位關(guān)系Figure 1 Localization relationship between mouse meiotic a-kleisins and recombination intermediates

2.2 α-kleisin和重組中間體熒光信號的鄰近程度

進一步分析兩種α-kleisin與重組中間體熒光信號的鄰近程度。結(jié)果顯示：在進行分析的80對偶線期同源染色體上，鄰近RAD51的RAD21L熒光信號程度(21.66%)遠(yuǎn)多于REC8熒光信號(12.66%)[圖2(a)]。在粗線期，當(dāng)MSH4出現(xiàn)在DSBs區(qū)域時，RAD21L與之的鄰近程度進一步增加到44.02%，而REC8的鄰近程度只有22.61%[圖2(b)]。然而，通過共免疫沉淀法未觀察到減數(shù)分裂型α-kleisin與MSH4或RAD51之間的相互作用(圖3)。由此可推測，減數(shù)第一次分裂前期粗線期期間，RAD21L的主要功能是間接的協(xié)助MSH4，保證 DSBs的修復(fù)順利完成。與之相比，REC8在DSBs的修復(fù)中起次要作用。

圖2 RAD21L 和REC8 的熒光信號與重組中間體的鄰近程度Figure 2 The proximities of fluorescence signals between RAD21L or REC8 and the recombination intermediates

分別利用RAD21L、REC8、MSH4和RAD51特異性抗體，對小鼠精母細(xì)胞提取液為材料制備的RAD21L和REC8的免疫沉淀物進行Western Blot分析。Input表示精巢提取液；control表示兔IgG免疫沉淀物。箭頭表示沒有檢測到α-kleisin與重組中間體之間相互作用。圖3 α-kleisin與重組中間體之間相互作用的檢測Figure 3 The detection of interaction between α-kleisins and recombinant intermediates

3 討論與結(jié)論

RAD21L是一種只存在于脊椎動物生殖細(xì)胞中的減數(shù)分裂型粘連蛋白α-kleisin亞基[12-14]，它與另一種普遍存在于所有真核生物中的減數(shù)分裂型α-kleisin亞基REC8在減數(shù)分裂過程中的表達具有很明顯的時空區(qū)別[16,18-19]：在時間上，RAD21L僅表達在減數(shù)第一分裂前期的粗線期為止，而REC8一直表達在整個前期；在空間上，兩者均存在于聯(lián)會復(fù)合體的側(cè)生組分和橫向纖維之間，并且RAD21L定位更為內(nèi)側(cè)。由此可推測，此兩種粘連蛋白可能對減數(shù)分裂型染色體運動具有獨特的作用或者主次作用。REC8主要貢獻于姐妹染色單體的粘連[19]，聯(lián)會復(fù)合體的裝配[10]，組織減數(shù)分裂染色單體結(jié)構(gòu)[24]，參與同源染色體重組[25]。植物細(xì)胞中也起著同樣的作用[26]。而RAD21L作用于同源染色體的配對、聯(lián)會及重組[12-14, 27]。研究指出，含有RAD21L的兩種不同粘連蛋白(RAD21L-SMC1α和RAD21L-SMC1β)在減數(shù)第一次分裂前期分擔(dān)不同的作用[28]。使用基因敲除(Knock Out)小鼠的幾項研究已報道減數(shù)分裂型粘連蛋白對同源染色體的重組至關(guān)重要。Rec8KO或Rad21lKO精母細(xì)胞在DSBs修復(fù)過程中出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，減數(shù)分裂停滯于前期[10,12]。甚至，Rad21LRec8dKO精母細(xì)胞顯示，即使發(fā)生DSBs也幾乎不修復(fù)，導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯在細(xì)線期[15]。然而，目前尚不清楚兩者在重組過程中的參與程度及其作用的分子機制。

本文通過結(jié)合免疫熒光染色法和3D-SIM技術(shù)分析減數(shù)分裂型α-kleisin亞基和重組中間體之間的關(guān)系，探究兩者對同源染色體重組的貢獻程度。通過3D-SIM觀察發(fā)現(xiàn)在偶線期，橫跨于部分同源染色體之間的RAD21L信號往往出現(xiàn)在MSH4和RAD51的臨近之處[圖1(h)和 (l)]，而REC8極少出現(xiàn)類似現(xiàn)象，大多存在于重組中間體的較遠(yuǎn)區(qū)域[圖1(p)和(t)]。在粗線期，DSBs修復(fù)往往發(fā)展到在同源染色體之間形成SEI結(jié)構(gòu)[9]。呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)并包繞姐妹染色單體或非姐妹染色單體是粘連蛋白獨有的結(jié)構(gòu)特性，利用其環(huán)狀結(jié)構(gòu)可隨意沿著染色體縱向滑移[圖1(b)黑色箭頭]。我們認(rèn)為，REC8受到SEI結(jié)構(gòu)的影響被動的滑移到重組中間體的邊角之處[圖1(p)和 (t)，圖4(c)和(d)橙色箭頭]。由此推測，在減數(shù)分裂型DSBs修復(fù)過程中RAD21L起主導(dǎo)作用，而REC8僅發(fā)揮協(xié)助作用。進一步的分析結(jié)果也證明了這一點。兩種粘連蛋白與重組中間體的熒光信號的鄰近程度具有很大的差距，鄰近RAD51和MSH4的RAD21L熒光信號程度遠(yuǎn)高于REC8熒光信號(圖2)。然而，由于在共免疫沉淀實驗中未檢測到粘連蛋白和重組中間體之間的相互作用，因此RAD21L與重組中間體直接作用的可能性不大。采用3D-SIM分析裂殖酵母減數(shù)分裂的研究表明，該生物種的唯一減數(shù)分裂型α-kleisin Rec8，在同源染色體的空間排列所必需的結(jié)構(gòu)平臺構(gòu)建中起著至關(guān)重要的作用[29]。因此，減數(shù)分裂型粘連蛋白亞基在同源染色體之間建立聯(lián)系的這一作用似乎在真核生物中均具有保守性。

(a)在細(xì)線期早期，RAD21L偶聯(lián)非姐妹染色單體，REC8粘連姐妹染色單體；(b)在細(xì)線期晚期，RAD21L識別DSBs發(fā)生部位，并開始聚集其周圍，REC8向DSBs部位的兩側(cè)移動；(c)在偶線期，RAD21L在DSBs周圍建立結(jié)構(gòu)平臺(綠色箭頭)，REC8受SEI結(jié)構(gòu)的影響被動滑向SEI的邊角之處(橙色箭頭)；(d)在粗線期，RAD21L維持結(jié)構(gòu)平臺直到DSBs修復(fù)完成為止，REC8維持姐妹染色單體的粘連。圖4 DSBs修復(fù)過程中RAD21L和REC8在染色體上的移動Figure 4 Movements of RAD21L and REC8 on chromosomes during DSBs repair

在脊椎動物的減數(shù)分裂中RAD21L和REC8的參與程度各有不同：在減數(shù)第一次分裂的前期，REC8的主要功能是粘連姐妹染色單體，次要功能是DSBs的修復(fù)，協(xié)助作用是聯(lián)會復(fù)合體的裝配。與之相比，RAD21L則在細(xì)線期的初期，偶聯(lián)同源染色體的非姐妹染色單體，初步建立同源染色體之間的聯(lián)系[圖4(a)]；在細(xì)線期的晚期，主要識別DSBs的發(fā)生部位，并建立DSBs修復(fù)所需要的結(jié)構(gòu)平臺[圖4(b)]；在偶線期，繼續(xù)維持DSBs周邊結(jié)構(gòu)，協(xié)助MSH4等重組中間體完成DSBs的修復(fù)[圖4(c)和 (d)]。該研究結(jié)果初步解釋了RAD21L在同源染色體重組過程中作用的分子機制并提供了其作用機制模型。