靳浩展，李 亮，魏琦麟，韓依辛，徐志宏，康樺華，向 蓉,4

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物 與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山 528231；3.廣東省農(nóng)業(yè) 技術(shù)推廣中心，廣州 510520；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

沙門氏菌(Salmonella)是一種全球危害嚴(yán)重的食源性致病菌[1]，目前已經(jīng)有2 600多種血清型被確認(rèn)，其主要通過(guò)污染肉、蛋、奶等食物和水源傳染給人類，通過(guò)毒力島等機(jī)制對(duì)機(jī)體造成損害進(jìn)而導(dǎo)致胃腸炎、副傷寒和傷寒等疾病[2-6]，嚴(yán)重危害人類的生命健康安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球超過(guò)1億人感染沙門氏菌，在國(guó)際公共衛(wèi)生安全問(wèn)題中占前兩位，美國(guó)每年感染沙門氏菌的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，歐洲沙門氏菌引起的疾病在食源性疾病中約占1/3，而中國(guó)細(xì)菌性疾病中由沙門氏菌引起的占70%以上[7-9]。在過(guò)去的幾十年中，由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的過(guò)度使用，沙門氏菌的耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重[10]，且多重耐藥情況已經(jīng)普遍存在。屠宰場(chǎng)是從養(yǎng)殖到餐桌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在屠宰過(guò)程中最易受到沙門氏菌的污染，而生豬及其制品是其主要的污染對(duì)象之一[11-12]。在屠宰過(guò)程中，豬胴體容易被腸道中的沙門氏菌污染，沙門氏菌隨著污染的豬肉及其制品傳給人類，同時(shí)也可能將其耐藥性帶給人類[13-14]，導(dǎo)致人類利用抗生素治療細(xì)菌病收效甚微甚至無(wú)效，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重的威脅。本研究通過(guò)對(duì)廣東省茂名地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌的耐藥性、耐藥基因和毒力基因的攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，分析該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌的耐藥表型以及耐藥基因、毒力基因的流行情況，以期為該地區(qū)沙門氏菌的危害評(píng)估和防控措施制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2020―2021年從廣東省茂名地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)屠宰過(guò)程中的豬肉、肝臟和脾臟等250份樣本中分離鑒定的19株沙門氏菌，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所獸藥研究室保存。

1.1.2 主要試劑 DHL培養(yǎng)基、LB肉湯、MH肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甘油、瓊脂糖、TAE緩沖液、2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、Gene Red核酸染料均購(gòu)自廣州順鋒生物科技有限公司；β-內(nèi)酰胺類(頭孢氨芐(CL)、頭孢哌酮(CFP))、氟喹諾酮類(氧氟沙星(OFL)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR))、氨基糖苷類(慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AK)、大觀霉素(SPT))、四環(huán)素類(四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DC))、酰胺醇類(氯霉素(CMP)、氟苯尼考(FFC))和磺胺類(復(fù)方新諾明(SXT)、磺胺異噁唑(SIZ))共14種抗菌藥物藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-20]合成17種耐藥基因引物(表1)和10種毒力基因引物(表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 17種耐藥基因檢測(cè)引物Table 1 Detection primers of 17 resistance genes

表2 10種毒力基因檢測(cè)引物Table 2 Detection primers of 10 virulence genes

1.3 菌株復(fù)蘇

將凍存的19株沙門氏菌進(jìn)行編號(hào)(SE-1～SE-19)，分別在DHL培養(yǎng)基上四區(qū)劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取有單個(gè)圓形、光滑和中心黑色或全部黑色或粉紅色的不透明菌落接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代3次。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

采用K-B紙片法對(duì)19株沙門氏菌進(jìn)行14種抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)，具體操作步驟和結(jié)果判定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)[21]藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.5 菌株DNA提取

參考鐘巧賢等[22]，利用煮沸法提取19株沙門氏菌的總DNA。取培養(yǎng)好的菌液3 mL，8 000 r/min離心10 min收集沉淀；加入200 μL ddH2O重懸，煮沸10 min；急凍10 min，10 000 r/min離心10 min收集上清即得到總DNA。

1.6 PCR檢測(cè)

以提取的沙門氏菌總DNA為模板，PCR檢測(cè)19株沙門氏菌對(duì)17種耐藥基因和10種毒力基因的攜帶情況。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見(jiàn)表1、2)40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將疑似陽(yáng)性菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)

19株沙門氏菌對(duì)14種抗菌藥物存在不同程度的耐藥，其中對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考和磺胺異噁唑的耐藥率均>50%，耐藥率最高為四環(huán)素、多西環(huán)素和氯霉素，耐藥率均為89.5%，最低為阿米卡星，耐藥率為0；按照藥物類型，四環(huán)素類藥物和酰胺醇類氯霉素的耐藥率較高，在80%以上，而氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物的耐藥率較低，均在10%左右(表3)。對(duì)沙門氏菌耐藥譜分析發(fā)現(xiàn)，最低對(duì)0種抗菌藥物耐藥，最高對(duì)11種抗菌藥物耐藥，多重耐藥率在90%左右，對(duì)5種及以上藥物耐藥率>50%(表4)。19株沙門氏菌共有12種耐藥譜型，其中4耐(4株)、6耐(4株)分別有3、2種耐藥譜型，3耐(3株)和5耐(2株)只有1個(gè)耐藥譜型，7耐(2株)耐藥譜型各不相同(表4)。說(shuō)明該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌的多重耐藥情況嚴(yán)重，且具有復(fù)雜的耐藥譜型。

表3 19株沙門氏菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug susceptibility test results of 19 Salmonella strains %

2.2 沙門氏菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

17種耐藥基因檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，除blaSHV、qnrB、rmtB3種耐藥基因未檢出外，其他14種耐藥基因均有檢出，其中blaTEM耐藥基因檢出率最高為84.2%，其余耐藥基因的檢出率在15.8%～73.7%之間，有8種耐藥基因的檢出率>50%(圖1)。blaTEM耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)沙門氏菌耐藥基因共存情況分析發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌最低攜帶2種耐藥基因，最高攜帶12種耐藥基因，其中攜帶7個(gè)及以上耐藥基因的沙門氏菌>50%；19株沙門氏菌具有16種耐藥基因組合類型，除了攜帶2、4、8種耐藥基因的沙門氏菌外，其余沙門氏菌的耐藥基因組合類型均不相同(表5)。表明該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌攜帶多個(gè)耐藥基因，且具有復(fù)雜的耐藥基因組合類型。

1～19，19株沙門氏菌blaTEM基因PCR產(chǎn)物；M，DL2000 DNA Marker；20，陰性對(duì)照 1-19,PCR products of blaTEM gene of 19 Salmonella strains;M,DL2000 DNA Marker;20,Negative control圖2 blaTEM耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection results of blaTEM resistance gene

表5 19株沙門氏菌攜帶耐藥基因譜Table 5 Resistance gene profiles of 19 Salmonella strains

2.3 沙門氏菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果

10種毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，mogA、mgtC、bcfA、araB基因都有檢出，其余6種毒力基因均未檢出，其中mogA基因的檢出率最高(100%)，其次是mgtC和bcfA基因，檢出率均為89.5%，araB基因的檢出率為73.7%(圖3)。mogA毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)沙門氏菌毒力基因共存情況分析發(fā)現(xiàn)，mogA、mgtC、bcfA和araB4種毒力基因同時(shí)被檢出的菌株數(shù)最多，占73.7%(14/19)(表6)。說(shuō)明該地區(qū)屠宰場(chǎng)豬肉中沙門氏菌主要攜帶mogA、mgtC、bcfA和araB4種毒力基因。

圖3 10種毒力基因在19株沙門氏菌中的檢出率Fig.3 Detection rate of 10 virulence genes in 19 Salmonella strains

1～19，19株菌mogA基因PCR產(chǎn)物；M，DL2000 DNA Marker；20，陰性對(duì)照 1-19,PCR products of mogA gene of 19 Salmonella strains;M,DL2000 DNA Marker;20,Negative control圖4 mogA毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR detection results of mogA virulence gene

表6 19株沙門氏菌攜帶毒力基因譜Table 6 Virulence gene profiles of 19 Salmonella strains

3 討 論

屠宰作為銜接生豬養(yǎng)殖和肉品加工的中間環(huán)節(jié)，對(duì)其安全監(jiān)管是保證肉品質(zhì)量安全的第一防線。屠宰環(huán)節(jié)的微生物及其耐藥性分析，不僅可為下游食品安全提供保障，而且能為上游養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的抗菌藥物合理應(yīng)用提供依據(jù)。隨著國(guó)家對(duì)生豬屠宰標(biāo)準(zhǔn)化的要求越來(lái)越高，對(duì)屠宰環(huán)節(jié)的微生物監(jiān)測(cè)也越來(lái)越規(guī)范。吳荔琴等[14]對(duì)2014―2016年從廣州生豬屠宰場(chǎng)豬盲腸分離的沙門氏菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)對(duì)四環(huán)素(80.13%)、多西環(huán)素(77.48%)、磺胺異噁唑(71.52%)、氨芐西林(62.25%)和大觀霉素(60.93%)的耐藥率較高，但對(duì)氟苯尼考(37.75%)的耐藥率較低。賀恒旭等[12]從河南部分地區(qū)不同規(guī)模的生豬屠宰企業(yè)豬不同部位分離的沙門氏菌主要對(duì)多西環(huán)素(95.02%)、氨芐西林(85.06%)、新霉素(79.67%)、氟苯尼考(73.44%)和四環(huán)素(72.61%)耐藥率較高。本研究中，19株沙門氏菌對(duì)6種抗菌藥物的耐藥率>50%，主要集中在對(duì)四環(huán)素類、酰胺醇類和磺胺類這3類抗菌藥，其中對(duì)四環(huán)素(89.5%)、多西環(huán)素(89.5%)和氯霉素(89.5%)的耐藥率最高，與吳荔琴等[14]檢測(cè)結(jié)果類似，但對(duì)氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類及磺胺類抗菌藥耐藥情況略有差異；與賀恒旭等[12]檢測(cè)結(jié)果相比，雖然都對(duì)四環(huán)素類耐藥率較高，但對(duì)氟苯尼考耐藥率偏低，可能與不同屠宰場(chǎng)生豬來(lái)源不同有關(guān)，但多重耐藥情況普遍嚴(yán)重。

blaTEM基因是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性桿菌常攜帶的耐藥基因，菌株通過(guò)基因表達(dá)合成β-內(nèi)酰胺酶使該類藥物失活，進(jìn)而達(dá)到耐藥的目的[23]。本研究中，blaTEM基因的檢出率最高(84.2%)，但分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率低于40%；aadA1和aac(6′)-Ⅰb基因的檢出率次之(73.7%、68.4%)，但對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥率低于15%；四環(huán)素類耐藥率最高，但四環(huán)素類耐藥基因少有檢出；氟喹諾酮類部分耐藥基因較高，但氟喹諾酮類藥物耐藥率較低；酰胺醇類、磺胺類耐藥基因的檢出率和相應(yīng)藥物耐藥率具有一致性，可能具有一定的聯(lián)系。本研究中耐藥基因和耐藥表型之間并不完全一致，可能是該類耐藥基因呈隱性存在不表達(dá)[24]；也可能是該類耐藥基因表達(dá)產(chǎn)物失去了活性[25]；還有可能是該菌株的耐藥機(jī)制極其復(fù)雜受多種基因共同調(diào)控。由此可知，本研究沙門氏菌攜帶多種耐藥基因，與其耐藥表型之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。

沙門氏菌的致病力由多種毒力因子相互作用共同產(chǎn)生[20]，其中毒力島(SPI)是染色體中含有大量與毒力相關(guān)基因的區(qū)域，mogA是SPI1中與侵襲相關(guān)的毒力基因[2]，mgtC是SPI3中編碼高親和力鎂轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(MgtS)的毒力基因，MgtS是沙門氏菌生存所必需的毒力因子，提供遺傳代謝過(guò)程中Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)[26]，bcfA是SPI4核心蛋白基因，與菌毛的形成有關(guān)[27]。王鑫盛[28]對(duì)河南和陜西不同地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)沙門氏菌毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mogA(100%)、sseL(100%)、bcfA(100%)、mgtC(99.3%)、araB(93.5%)基因的檢出率較高。黃秀梅等[29]對(duì)山東不同地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)沙門氏菌毒力基因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，mgtC(100%)、bcfA(100%)、mogA(97.99%)、araB(97.99%)、sseL(67.11%)基因的檢出率較高，spvR、spvA、spvB、spvC、spvD基因的檢出率均低于3%。本研究中，19株沙門氏菌對(duì)mogA、mgtC、bcfA和araB4種毒力島基因的檢出率都在70%以上，其中對(duì)mogA基因的檢出率高達(dá)100%，與王鑫盛[28]和黃秀梅等[29]的檢測(cè)結(jié)果類似，但sseL基因檢出率偏低，說(shuō)明不同地區(qū)這4種毒力基因在沙門氏菌中攜帶率高，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

19株沙門氏菌分離株多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素和氯霉素高度耐藥，攜帶多種耐藥基因和毒力基因，其中blaTEM、aadA1和aac(6′)-Ⅰb3種耐藥基因攜帶率高，但與其耐藥表型不完全一致，且具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，mogA、mgtC、bcfA和araB4種毒力基因攜帶率高。本研究結(jié)果為廣東省茂名地區(qū)沙門氏菌的監(jiān)測(cè)和防治提供了數(shù)據(jù)支持。