魏佳榮，張貝貝，馬騰壑，2，李夢霄，李雪男，王 斌，付冠華，王紅娜，劉 超

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056038；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，邯鄲 056038；3.河北天凱食品有限責(zé)任公司，邢臺 054100)

B型細(xì)胞周期蛋白(cyclin B,CCNB)是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，CCNB在細(xì)胞分裂進(jìn)程中發(fā)揮重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[1]。到目前為止，在家禽上總共發(fā)現(xiàn)了3種CCNB，即CCNB1、CCNB2和CCNB3，分別由CCNB1、CCNB2和CCNB3基因編碼[2-3]。研究證明，CCNB在細(xì)胞中的積累與降解會影響細(xì)胞周期激酶(cyclin-dependent kinases，CDK1)的激活與失活，從而影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)[4-5]。CCNB作為CDK1激活的重要結(jié)合因子，可緩解由于DNA損傷導(dǎo)致的G2/M阻滯，從而恢復(fù)CDK1部分功能，減少因細(xì)胞缺陷引起的病變[6]。CCNB2調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[7-8]。Wu等[9]研究結(jié)果顯示，CCNB2在G1期合成，隨后表達(dá)量驟降，其缺陷會使G2/M檢查點(diǎn)失效進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的劇烈增殖。Luo等[10]在小鼠上的試驗(yàn)證明，CCNB2在卵母細(xì)胞分裂前期表達(dá)量上升，到后期急速下降，推測CCNB2基因表達(dá)量的差異會影響卵母細(xì)胞的正常增殖。張璐瑩[11]在黃當(dāng)歸醇抑制腫瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)中檢測到CCNB2基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著上升，使得細(xì)胞的增殖與遷移加快。總之，CCNB2是細(xì)胞分裂增殖過程中的一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，是G2/M過渡時(shí)的一個(gè)催化要素[12]。已有研究表明，CCNB2基因?qū)倚舐涯讣?xì)胞的成熟具有關(guān)鍵作用[13-14]，但其在家禽上的表達(dá)規(guī)律及其在卵泡成熟過程的功能鮮見報(bào)道。

選擇性剪接(alternative splicing,AS)是通過不同的剪接方法和剪接位點(diǎn)從單個(gè)前體mRNA產(chǎn)生不同成熟mRNA剪接異構(gòu)體的過程[15]。AS事件通常被分為五大類：外顯子跳過、5′-端可變剪接、3′-端可變剪接、互斥外顯子和內(nèi)含子保留[16]，Pandey等[17]研究了12種不同的后生動物基因組中不同類型剪接體事件的程度，結(jié)果表明外顯子跳過事件在脊椎動物中更普遍，而內(nèi)含子保留事件在無脊椎動物中更豐富。細(xì)胞周期蛋白表達(dá)過程中廣泛存在選擇性剪接現(xiàn)象，本研究以河北省地方雞品種太行雞為試驗(yàn)動物，克隆鑒定分析CCNB2基因不同剪接異構(gòu)體，研究其在雞卵泡不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探討該基因不同剪接異構(gòu)體的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 太行雞來自河北天凱食品有限責(zé)任公司太行雞育種基地。取5只飼養(yǎng)條件相同、體重相近的43周齡健康太行雞母雞，頸靜脈放血處死，打開腹腔，立即取出卵巢，取不同發(fā)育時(shí)期卵泡，包括小白卵泡(small white follicle,SWF)、大白卵泡(large white follicle,LWF)、小黃卵泡(small yellow follicle,SYF)、大黃卵泡(large yellow follicle,LYF)以及F6～F1等級卵泡。液氮快速凍存，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器 EASY spin Plus RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit、熒光定量PCR試劑盒和常規(guī)PCR試劑均購自江蘇諾唯贊生物科技股份有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自德國耶拿分析儀器股份公司；普通PCR儀購自上海研福生物科技中心；高速離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超低溫冰箱、低溫冰箱均購自青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平購自奧豪斯(常州)有限公司；高溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海藍(lán)豹試驗(yàn)設(shè)備有限公司；小型振蕩器購自北京銘成基業(yè)科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)原雞CCNB2基因序列(GenBank登錄號：XM_015278893.2和XM_015278892.2)，利用Primer Premier 5.0軟件按照圖1設(shè)計(jì)CCNB2基因剪接異構(gòu)體鑒定引物，引物序列為：CCNB2-F：5′-AAGATGAAAAGCAGTGGGA-3′；CCNB2-R：5′ -AAGACAGAGGACAGGGATAC-3′。引物由蘇州金唯智股份有限公司合成。

圖1 CCNB2剪接異構(gòu)體鑒定模式圖Fig.1 Schematic diagram of CCNB2 splice isoforms identification

1.3 太行雞CCNB2基因剪接異構(gòu)體克隆鑒定

按照EASY spin Plus RNA快速提取試劑盒說明提取太行雞小黃卵泡總RNA。利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈，利用特異性PCR引物擴(kuò)增CCNB2基因。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，連接至pMD19-T載體，連接體系為Solution Ⅰ 2 μL，pMD19-T載體1 μL，目的片段2 μL。在常溫條件下連接10 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單克隆后，在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定后送金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 相似性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用Seqman Edit軟件拼接CCNB2基因完整開放閱讀框(ORF)。利用DNAMAN軟件對3種剪接異構(gòu)體核苷酸序列進(jìn)行比對，利用Mega 6.0軟件進(jìn)行不同剪接異構(gòu)體氨基酸序列的相似性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。原雞(登錄號：XP_015134378.3)、艾草榛雞(登錄號：XP_042680513.1)、雉雞(登錄號：XP_031472340.1)、紅松雞(登錄號：XP_042731524.1)、吐綬雞(登錄號：XP_003209452.1)、鵪鶉(登錄號：XP_015727897.1)、盜珠雞(登錄號：XP_021263444.1)、紅鴨(登錄號：XP_035192130.1)、雀鵝(登錄號：NXI68343.1)、鬃林鴨(登錄號：XP_ NXK48899.1)、云斑林鶉(登錄號：NXJ11666.1)、豬(登錄號：NP_001107754.1)、牛(登錄號：NP_776689.2)、馬(登錄號：XP_023472342.1)、羊(登錄號：XP_004010609.1)和小鼠(登錄號：CAJ18494.1)CCNB2基因氨基酸序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.5 不同剪接異構(gòu)體的亞細(xì)胞定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

1.5.1CCNB2基因剪接異構(gòu)體蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用在線服務(wù)器PSORT WWW Server中的PSORTⅡ Prediction(http:∥psort.hgc.jp/form.html)程序進(jìn)行CCNB2基因不同剪接異構(gòu)體蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.5.2CCNB2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件NPS@:Network Protein Sequence Analysis(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對太行雞CCNB2基因不同剪接異構(gòu)體的蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.6 太行雞CCNB2基因剪接異構(gòu)體在卵巢和不同發(fā)育時(shí)期卵泡的表達(dá)規(guī)律

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測3種剪接異構(gòu)體在卵巢和不同發(fā)育時(shí)期卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF以及F6～F1等級卵泡)中的相對表達(dá)量。采用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)雞CCNB2基因序列(GenBank登錄號:XM_015278893.2)設(shè)計(jì)太行雞CCNB2基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列，以GAPDH基因作為內(nèi)參(表1)，引物均由蘇州金唯智股份有限公司合成。按照EASY spin Plus RNA快速提取試劑盒說明提取太行雞各組織總RNA，利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit將不同組織的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。利用2-△△Ct法來計(jì)算基因相對表達(dá)量，以卵巢組織中的表達(dá)量為對照。

表1 太行雞CCNB2基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物信息Table 1 Real-time quantitative PCR primer information of CCNB2 gene in Taihang chickens

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan氏法進(jìn)行組間差異顯著性分析，P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 太行雞CCNB2基因克隆

太行雞CCNB2基因剪接異構(gòu)體PCR鑒定結(jié)果見圖2A，條帶大小約為247 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR結(jié)果如圖2B所示，其中2、4和6泳道的樣品經(jīng)菌液測序，發(fā)現(xiàn)為CCNB2基因的3種剪接異構(gòu)體，經(jīng)序列拼接后，分別命名為CCNB2-AS1，CCNB2-AS2和CCNB2-AS3，長度分別為1 173、1 152和1 206 bp，分別編碼390、383和401個(gè)氨基酸。核酸序列比對分析結(jié)果表明，3種剪接異構(gòu)體核酸序列相似，差異序列主要位于序列前端(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1，CCNB2基因剪接異構(gòu)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2、4和6，菌液PCR產(chǎn)物；3、5、7、8和9，空質(zhì)粒 M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification products of CCNB2 gene splice isoforms；2，4 and 6，PCR products of bacterial solution；3,5,7,8 and 9，Empty plasmids圖2 太行雞CCNB2基因剪接異構(gòu)體(A)和菌液(B)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of CCNB2 gene splice isoforms (A) and bacterial fluid (B) in Taihang chickens

圖3 太行雞CCNB2基因3種剪接異構(gòu)體的部分核苷酸序列比對Fig.3 Partial nucleotide sequence alignment of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.2 不同物種CCNB2基因的氨基酸序列相似性比對

太行雞CCNB2-AS1、CCNB2-AS2和CCNB2-AS3 3個(gè)剪接體之間的氨基酸序列相似性均為97.00%，這3個(gè)剪接體均與原雞的相似性最高，分別為99.71%、99.71%和100%(表2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，3種剪接異構(gòu)體在進(jìn)化上與原雞親緣關(guān)系最近，其次為雉雞(圖4)，與相似性分析結(jié)果一致。

表2 不同物種間CCNB2基因氨基酸序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of amino acid sequence of CCNB2 gene among different species %

圖4 太行雞CCNB2基因3種剪接異構(gòu)體氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 太行雞CCNB2基因剪接異構(gòu)體蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測 太行雞CCNB2-AS1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(52.2%)，其他定位于細(xì)胞核(26.1%)、細(xì)胞骨架(13.0%)、液泡(4.3%)和線粒體(4.3%)。CCNB2-AS2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(52.2%)，其他定位于線粒體(17.4%)、細(xì)胞核(8.7%)、液泡(4.3%)、細(xì)胞骨架(4.3%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(4.3%)和細(xì)胞外(8.7%)。CCNB2-AS3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(52.2%)，其他定位于細(xì)胞核(26.1%)、線粒體(17.4%)、液泡(4.3%)和細(xì)胞外(4.3%)。

2.3.2 太行雞CCNB2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 太行雞CCNB2-AS1蛋白二級結(jié)構(gòu)中，217個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占比為55.64%；13個(gè)氨基酸參與氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈，占比為3.33%；155個(gè)氨基酸參與無規(guī)則卷曲；占比為39.74%(圖5A)。CCNB2-AS2蛋白二級結(jié)構(gòu)中，220個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占比為57.44%；20個(gè)氨基酸參與氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈，占比為5.22%；136個(gè)氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比35.51%(圖5B)。CCNB2-AS3蛋白二級結(jié)構(gòu)中，237個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占比為59.10%；15個(gè)氨基酸參與氨基酸構(gòu)成的延伸鏈，占比為3.74%；142個(gè)氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比為35.41%(圖5C)。3種剪接異構(gòu)體的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主。

最長線，α-螺旋；次長線，延伸鏈；短線，無規(guī)則卷曲 Longest line,Alpha helix;Secondary long line,Extended chain；Short line,Random coil圖5 太行雞CCNB2-AS1(A)、CCNB2-AS2(B)和CCNB2-AS3(C)蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of CCNB2-AS1 (A),CCNB2-AS2 (B) and CCNB2-AS3 (C) proteins in Taihang chickens

2.4 太行雞CCNB2基因3種剪接異構(gòu)體在卵巢和不同發(fā)育時(shí)期卵泡的表達(dá)規(guī)律

CCNB2-AS1在F6時(shí)期卵泡中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)，從F5開始，表達(dá)量顯著下降，且F5～F1的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，除了大黃卵泡，其他等級前卵泡中的表達(dá)量顯著高于卵巢以及F6以外的等級卵泡(圖6A)；CCNB2-AS2在大白卵泡中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05)，且從小黃卵泡開始，隨著卵泡發(fā)育始終以較低水平表達(dá)(圖6B)；CCNB2-AS3在F6～F4時(shí)期卵泡中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P<0.05，圖6C)。

3 討 論

選擇性剪接現(xiàn)象在家禽生長發(fā)育過程中廣泛存在，有報(bào)道稱約有30%基因存在剪接異構(gòu)體[18]。雖然目前為止已發(fā)現(xiàn)的編碼細(xì)胞周期蛋白的基因只有15種，但是由于剪接異構(gòu)體的存在使得機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類增加數(shù)倍，約50種的細(xì)胞周期蛋白在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用，參與機(jī)體細(xì)胞的DNA復(fù)制[19-20]。目前關(guān)于CCNB2基因在人上研究較多，一般將其作為肝癌的預(yù)后標(biāo)志物[21]。CCNB2基因作為腫瘤轉(zhuǎn)移惡化的關(guān)鍵因子，調(diào)控肺癌細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移[22]，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞衰老[23]，并可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖，這些功能的發(fā)揮都與其細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能有關(guān)。在家畜上，牛CCNB2基因可參與體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟過程[24]。而在家禽中其是否參與調(diào)控卵泡發(fā)育的研究鮮見報(bào)道。本研究在太行雞(國家畜禽遺傳資源委員會審定的河北省第一個(gè)地方家禽品種)小黃卵泡中克隆鑒定到CCNB2基因的3種剪接異構(gòu)體，長度分別為1 173、1 152和1 206 bp，分別編碼390、383和401個(gè)氨基酸，ORF的5′-端1 035個(gè)核苷酸、345個(gè)氨基酸是一致的，說明其功能的差異可能由ORF起始序列引起的。

通過氨基酸序列相似性比對分析發(fā)現(xiàn),相較于鵝和鴨，不同品種雞中CCNB2的相似性較高，但是也存在一定差異，說明該基因在雞中功能保守，可能發(fā)揮相似功能，而且該基因與其他物種相似性較低，說明不同物種可能發(fā)揮不同功能，具體CCNB2在雞中發(fā)揮的功能還有待進(jìn)一步探究。在牛上細(xì)胞周期蛋白發(fā)揮功能的主要位置在細(xì)胞質(zhì)[25]，這與本研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)對3種剪接異構(gòu)體亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其同樣主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮與其在細(xì)胞中的位置密切相關(guān)，因此，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，3種剪接異構(gòu)體的主要折疊方式為α-螺旋。

由于卵泡選擇是影響雞生殖力的重要因素[26]。本研究發(fā)現(xiàn)3種剪接異構(gòu)體在不同時(shí)期卵泡中呈不同的表達(dá)模式，整體而言CCNB2-AS1在等級前卵泡中表達(dá)水平高于等級卵泡，CCNB2-AS2則在白卵泡中表達(dá)水平高于其他時(shí)期，而CCNB2-AS3表達(dá)模式則與CCNB2-AS1相反，值得注意的是，在卵泡選擇的關(guān)鍵時(shí)期，即小黃卵泡向大黃卵泡發(fā)育過程中CCNB2-AS2表達(dá)并無顯著差異，可能CCNB2-AS2并不參與卵泡選擇而是參與調(diào)控其他功能。卵泡之所以在整個(gè)性成熟期能夠發(fā)育，主要是通過卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)控[27-28]，CCNB2-AS3與CCNB2-AS1相反的表達(dá)情況，推測可能作為2種不同的調(diào)控因子在不同時(shí)期卵泡中發(fā)揮作用。前人研究顯示雞卵泡顆粒細(xì)胞膜上有大量促卵泡素受體(FSHR)，在等級前卵泡中伴隨著FSHR高表達(dá)的同時(shí)，CCNB2基因表達(dá)量上升，在排卵后期表達(dá)水平則較低[29-30]，與本研究中CCNB2-AS1 mRNA表達(dá)結(jié)果相似。另外，3種剪接異構(gòu)體在卵泡選擇前后的SYF卵泡與LYF卵泡中的表達(dá)情況并不一致，具體功能仍需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究鑒定到太行雞CCNB2基因的3種剪接異構(gòu)體，二級結(jié)構(gòu)均是以α-螺旋為主，其在各時(shí)期卵泡中均有表達(dá)，3種剪接異構(gòu)體在等級前卵泡中的表達(dá)趨勢存在差異，但在等級卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)均呈下降趨勢。結(jié)果為進(jìn)一步研究太行雞CCNB2基因?qū)Υ菩苑敝彻δ艿挠绊懱峁├碚撝С帧?/p>