鄧占釗，禹保軍，曹國偉，張 娟，石永宏，胡偉龍，仇秀玲

(1.彭陽縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，固原 756599；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏九三零生態(tài)農(nóng)牧有限公司，銀川 750021)

隨著家禽育種工作對生長速度的高強度選擇，快大型育肥雞生長至42日齡時體重可達(dá)2.5 kg以上[1]。盡管肉雞具有較高的生長速度和產(chǎn)肉性能，但其肉品質(zhì)量卻顯著下降，尤其肉品風(fēng)味下降較快[2]。因此，在禽類生長速度提高的前提下，改善肉質(zhì)風(fēng)味，培育肉質(zhì)優(yōu)良、風(fēng)味獨特的優(yōu)質(zhì)地方雞種成為現(xiàn)代畜禽分子育種的主要研究方向。在各種肉類產(chǎn)品中，雞肉因其高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特性成為當(dāng)前消費者營養(yǎng)補給的重要食品。靜原雞作為優(yōu)良的地方雞種，個體小、生長速度慢，肌肉內(nèi)肌苷酸(IMP)含量高[3]，是肌肉品質(zhì)研究的理想動物模型。

microRNA(miRNA)是一類小的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，長度為17～24 nt[4]。miRNA主要通過介導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合靶基因從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及穩(wěn)定性[5]，其作為一種在物種間高度保守的短鏈非編碼RNA，主要通過翻譯抑制或使mRNA降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。當(dāng)前關(guān)于miRNA對肉品質(zhì)的調(diào)控研究主要集中在其對骨骼肌發(fā)育調(diào)控[7]、肉質(zhì)形成[8]、不同肌肉類型形成[9-11]、不同體組織形成[12]、不同處理后影響[13]等方面。研究證實，let-7a在動物生長發(fā)育、細(xì)胞分化與凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[14-16]。實驗室前期通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，let-7a-5p在靜原雞胸肌和腿肌組織中高度表達(dá)，且在胸肌中表達(dá)水平顯著高于腿肌[17]，推測let-7a-5p可能參與調(diào)節(jié)靜原雞肌肉發(fā)育及肉品質(zhì)。鑒于此，本試驗通過成熟序列比對、靶基因功能注釋及靜原雞各組織表達(dá)譜分析，探討let-7a-5p在靜原雞肌肉組織中的功能作用，以期為進(jìn)一步探究let-7a-5p的功能和作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集180日齡靜原雞公雞和母雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織，用手術(shù)剪快速分離成黃豆大小，放入凍存管投入到液氮罐中，帶回實驗室于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 let-7a-5p序列比對及保守性分析 從已驗證的miRNA-Seq結(jié)果中篩選出差異表達(dá)的let-7a-5p，其測序獲得的成熟序列為：5′-UGAGGUAG-UAGGUUGUAUAGUU-3′。在miRbase(http:∥www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫中下載人(Homosapiens，hsa)、小鼠(Musmusculus，mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus，rno)、獼猴(Macacamulatta，mml)、牛(Bostaurus，bta)、原雞(Gallusgallus，gga)、鱈魚(Gadusmorhua，gmo)和山羊(Caprahircus，chi)的let-7a-5p成熟序列(表1)。利用Mega 7.0軟件將miRNA-Seq中獲得的let-7a-5p的成熟序列與上述8個物種進(jìn)行比對，分析其物種間保守性。

1.2.2 let-7a-5p靶基因預(yù)測 將let-7a-5p信息提交在線軟件miRanda (https:∥www.miranda.org/)、TargetScan (http:∥www.targetscan.org/)和miRDB (http:∥mirdb.org/miRDB/)預(yù)測靶基因，三者交集組成的基因集合可進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 let-7a-5p靶基因功能富集分析 使用在線數(shù)據(jù)庫DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov/)對靶基因集合進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05為閾值定義靶基因顯著富集的GO條目和KEGG通路。

1.2.4 let-7a-5p與靶基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape軟件繪制let-7a-5p與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 組織表達(dá)分析 使用RNAiso Plus試劑(Code No.D9108A)提取靜原雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real-time)(TaRaKa公司)說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，―20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎们o環(huán)法設(shè)計let-7a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物(RT)和特異性定量引物，以U6為內(nèi)參，引物序列見表2。使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR試劑盒(QIAGEN公司)在CFX系統(tǒng)中進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR Green 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，共39個循環(huán)；熔解曲線分析：60～95 ℃ 4 s。每個樣本3個重復(fù)。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用2―ΔΔCt計算各個樣品的基因相對表達(dá)量，使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 物種間保守性

將雞let-7a-5p成熟序列與人、小鼠、大鼠、獼猴、牛、原雞、鱈魚和山羊進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其與8個物種let-7a-5p的成熟序列完全一致，長度均為22 nt，表現(xiàn)出高度的物種保守性。

2.2 let-7a-5p靶基因預(yù)測

利用在線軟件miRDB、TargetScan、miRanda預(yù)測得到let-7a-5p的靶基因分別為562、365和283個，三者交集共獲得38個基因集合(圖1)。

圖1 let-7a-5p的靶基因預(yù)測結(jié)果Fig.1 Predicted results of let-7a-5p target genes

2.3 let-7a-5p靶基因GO功能注釋分析

對38個let-7a-5p靶基因集合注釋分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，靶基因富集較多的前4個GO條目分別是細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)和生物過程調(diào)節(jié)(regulation of biological process)；在細(xì)胞成分中，靶基因在細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)富集最多，其次在細(xì)胞器(organelle)和細(xì)胞器部分(organelle part)富集較多；在分子功能中，靶基因富集最多的GO條目是結(jié)合(binding)，其次在催化活性(catalytic activity)條目也富集較多(圖2)。

圖2 let-7a-5p靶基因的GO功能富集條目Fig.2 GO function enrichment terms of let-7a-5p target genes

2.4 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，let-7a-5p的38個靶基因在聚酮糖單元生物合成(polyketide sugar unit biosynthesis)、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、TGF-β信號通路(TGF-beta signaling pathway)和加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收(vasopressin-regulated water reabsorption)顯著富集。前20個通路中富集最多的是代謝途徑(metabolic pathways)、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)(圖3)。

圖3 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of let-7a-5p target genes

2.5 let-7a-5p靶基因互作分析

miRNA主要作用于mRNA的3′-UTR，通過抑制或降解靶基因發(fā)揮調(diào)控作用。在miRNA-靶基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，一個miRNA可以靶向調(diào)節(jié)多個mRNA的表達(dá)。本研究中，let-7a-5p通過靶向抑制基因表達(dá)，從而在生物過程中扮演重要角色(圖4)。

圖4 let-7a-5p與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.4 let-7a-5p and target gene regulatory network

2.6 靜原雞let-7a-5p的組織表達(dá)

由圖5可知，let-7a-5p在靜原雞公、母雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織中均有表達(dá)，且在胸肌和腿肌中表達(dá)量均較高，其中，在母雞的心臟和腿肌中高表達(dá)，與其他幾個組織間存在顯著差異(P<0.05)；除了在公雞的肝臟中表達(dá)量較低外，其他組織中表達(dá)量相對較高，且肝臟與肺臟間存在顯著差異(P<0.05)。

①A，母雞；B，公雞。②數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05) ①A，F(xiàn)emale;B,Male.②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 靜原雞let-7a-5p的組織表達(dá)分析Fig.5 Tissue expression analysis of let-7a-5p in Jingyuan chickens

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，miRNA功能在不同物種中的研究日益增多。在豬的肌肉形成和肉質(zhì)調(diào)控方面[18-19]，miR-1、miR-133、miR-206被證實在肌細(xì)胞形成過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[20]，其中miR-1和miR-133主要在骨骼肌的形成過程中發(fā)揮作用，而miR-206主要通過調(diào)控組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)的表達(dá)來調(diào)控成肌細(xì)胞的分化過程[21]。在快大型白羽肉雞與杏花雞的研究中發(fā)現(xiàn)，生長激素受體(GHR)基因是差異表達(dá)基因miR-146b-3p作用的靶點，且miR-34c、miR-223、miR-146b-3p、miR-21和miR-205a在肌肉生長調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[22]。大量研究表明，位于細(xì)胞質(zhì)的一些lncRNAs可與miRNA結(jié)合而在動物生長、肌肉發(fā)育[23]及脂肪的形成和代謝[24]過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。lnc-MD1可與MAML1和MEF2C競爭性結(jié)合miR-133和miR-155，從而提高這2個基因的表達(dá)水平，在肌肉分化中發(fā)揮作用[23]。但目前有關(guān)miRNA在靜原雞肌肉生長發(fā)育及肉品質(zhì)上的相關(guān)研究甚少。

miRNA的表達(dá)具有明顯的種屬、組織特異性及時空特征，明確miRNA在特定發(fā)育階段不同組織器官中的表達(dá)水平，對研究miRNA在這些組織器官和發(fā)育階段的生物學(xué)過程中所起的作用具有重要意義。let-7家族是miRNA中研究最深入的小RNA，參與發(fā)育時序性調(diào)節(jié)[25]。研究發(fā)現(xiàn)，let-7a在腫瘤細(xì)胞的增殖[26-31]、分化[32-33]、脂肪生成及藥物敏感性[34]等方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用，過表達(dá)let-7a可以抑制肺癌在裸鼠中的轉(zhuǎn)移[35]。因此，let-7a在機體多種生物學(xué)過程中具有重要的調(diào)控功能。本研究使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測let-7a-5p的靶基因，根據(jù)miRDB、TargetScan和miRanda的不同算法預(yù)測得到靶基因數(shù)分別為562、365和283個，為了提高靶向關(guān)系的準(zhǔn)確性，取3個軟件預(yù)測的交集作為下一步分析的基因集合，共有38個靶基因集合在細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)節(jié)等生物過程，細(xì)胞和細(xì)胞部分等細(xì)胞成分，以及結(jié)合和催化活性等分子功能中。let-7a-5p預(yù)測的靶基因顯著富集于聚酮糖單元生物合成、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、TGF-β信號通路和加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收通路中。TGF-β是一類多功能的分泌蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，包含3種亞型：TGF-β1、TGF-β2以及TGF-β3。在成肌細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中，TGF-β的3種亞型均可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，通過促進(jìn)MyoD降解和抑制MyoG的表達(dá)來抑制成肌細(xì)胞的分化[36]。因此，推測let-7a-5p通過TGF-β信號通路作用于靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)靜原雞成肌細(xì)胞的增殖與分化。

本研究中，let-7a-5p在靜原雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織中均有表達(dá)，且在公、母雞的胸肌和腿肌中表達(dá)量均較高，表明let-7a-5p可能調(diào)控靜原雞肌肉的生長發(fā)育，但仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

let-7a-5p的成熟序列在多個物種間高度保守，其38個靶基因集合顯著富集于聚酮糖單元生物合成、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、TGF-β信號通路和加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收等信號通路。let-7a-5p下游可能通過調(diào)節(jié)多個潛在靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控靜原雞成肌細(xì)胞的增殖與分化。let-7a-5p在靜原雞胸肌和腿肌中表達(dá)量較高，說明其在靜原雞肌肉組織生長發(fā)育中扮演著重要角色。