朱瑾嫻 范雅雯 龔勝蘭 莊園妃 劉春貴 唐新征

廣州中醫(yī)藥大學第六臨床醫(yī)學院 廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院（福田）心血管病科，廣東深圳 518034

冠狀動脈微循環(huán)障礙（coronary microvascular dysfunction，CMVD）是指多種病理因素導致的血管內(nèi)徑小于0.5 mm 的微血管結(jié)構(gòu)和/或功能異常，臨床多表現(xiàn)為存在勞力性心絞痛癥狀或存在心肌缺血客觀證據(jù)[1-2]。研究表明，CMVD 與未來主要不良心臟事件有關(guān)，同時也被認為是射血分數(shù)保留的心力衰竭發(fā)生的相關(guān)因素，并與死亡風險增加及心臟術(shù)后器官功能障礙相關(guān)[3-6]。

近年來，CMVD 的臨床檢出率逐漸升高，對于CMVD 的研究也愈漸深入。目前對于CMVD 大鼠模型的建立方法主要是開胸注射法、經(jīng)頸動脈導管介入法[7-8]，后者存在操作復雜且介入導管成本較高的缺點，故前者更為常見。月桂酸鈉作為開胸注射法最常用的化學誘導藥物，其誘導建立的大鼠CMVD 模型廣泛應(yīng)用于CMVD 發(fā)病機制及藥物治療的研究中，但目前對于月桂酸鈉致大鼠CMVD 模型的給藥劑量及給藥方式尚未有定論。故本研究通過3 種不同給藥方案造模的比較，優(yōu)選出合理的月桂酸鈉造模給藥方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF 級SD 雄性大鼠50 只，6～8 周齡，體重（200±20）g，購自珠海百試通動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0051，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0230。飼養(yǎng)及手術(shù)操作于深圳拓普生物科技有限公司SPF 實驗動物中心進行；飼養(yǎng)條件：每籠2～3 只，自由飲食，通風、照明良好，室溫22～24℃，相對濕度67%。實驗動物使用符合3R 原則。本研究通過實驗室倫理委員會審批（TOP-IACUC-2021-0104）。

1.2 藥物與試劑

2%異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22-16）；月桂酸鈉（美國Sigma 公司，貨號：L9755）；HE 染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G1006）；Heidenhain 染色液（Solarbio，批號：G4480）；GENMED 石蠟切片纖維蛋白（fibrin）卡斯塔萊斯（carstairs）染色試劑盒（美國GENMED 公司，批號：GMS80128.1）。

1.3 儀器及器械

外科手術(shù)器械；小動物氣體麻醉機（美國Matrx公司，7025）；U-40 胰島素注射器（上海康德萊企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司）；HS-B7126-B 型石蠟包埋機（沈陽恒松科技有限公司）；ART-300 型自動脫水機（湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司）；QPJ-1C 生物病理切片機（天津愛華醫(yī)療器械有限公司）；BX-53F 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；vevo2100 型彩色多普勒超聲儀（美國Visualsonics 公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 模型的建立與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，使用隨機數(shù)字表法將其分為空白組、假手術(shù)組和模型組1～3，每組10 只。空白組：未行任何干預；模型組采取經(jīng)心尖部注入月桂酸鈉的方法建立CMVD 模型[9]，根據(jù)造模方法不同分為三組，即模型組1 采用擴張肋間后擠出心臟+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）1 次、模型組2 采用擴張肋間后擠出心臟+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）2 次、模型組3 采用擴張肋間后擠出心臟+夾閉主動脈根部+心尖注入月桂酸鈉（1 mg/kg）1 次，見圖1。假手術(shù)組操作同模型組2，注入等量生理鹽水。術(shù)后連續(xù)72 h 肌肉注射4 萬單位青霉素預防感染。

圖1 大鼠CMVD 模型建立

1.4.2 超聲心動圖檢測 術(shù)后72 h 將各組大鼠以異氟烷吸入麻醉后仰臥位固定，取胸骨短軸觀切面，M 型超聲模式下連續(xù)計算3 個心動周期的左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）的平均值。

1.4.3 形態(tài)學及病理學分析 術(shù)后72 h 完成超聲心動圖后禁食12 h，各組大鼠生理鹽水灌注后取出心臟，固定包埋，切片進行HE、Heidenhain 及Carstairs 染色觀察心肌組織變化，以見到心肌缺血、微血管內(nèi)血栓形成且大血管未見損傷為模型成功。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況

空白組大鼠存活率為100%（10/10）；手術(shù)大鼠死亡率為17.5%（7/40），死亡原因為器械誤觸破血管（1 只）、進針過深穿破心臟（1 只）、操作時間過久（4 只）、麻醉過量（1 只）。

2.2 各組大鼠LVEF 比較

假手術(shù)組與空白組LVEF 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組1～3 LVEF 均降低（P＜0.05）；與模型組2 比較，模型組1、3 LVEF升高（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 各組大鼠LVEF 比較（%，）

表1 各組大鼠LVEF 比較（%，）

注 與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組2 比較，cP＜0.05。LVEF：左室射血分數(shù)

圖2 各組大鼠左室射血分數(shù)

2.3 心肌組織病理形態(tài)學檢測結(jié)果

2.3.1 HE 染色 空白組及假手術(shù)組大鼠心肌排列整齊，細胞核形態(tài)規(guī)則，冠狀動脈微血管內(nèi)未見明顯血栓形成。模型組1～3 均可見不同程度冠狀動脈微血管內(nèi)血栓形成，周邊可見不同程度的炎癥細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂，組織水腫，大血管無明顯血栓形成。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌病理變化（HE 染色，400×）

2.3.2 Heidenhain 染色 空白組及假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維組織呈紅色，細胞核呈黑色；模型組1～3 均可見不同程度的點狀、片狀及團塊狀心肌纖維黑染缺血灶。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌缺血情況（Heidenhain 染色，400×）

2.3.3 Carstairs 染色 空白組及假手術(shù)組大鼠微血管及心肌較大動脈血管內(nèi)無明顯血栓形成；模型組1～3 均可見微血管中存在血小板與纖維蛋白重疊的紫色血栓形成。見圖5。

圖5 各組大鼠微血管內(nèi)血栓情況（Carstairs 染色，400×）

3 討論

CMVD 存在于多種心臟或全身疾病中，如心肌病、動脈粥樣硬化、自身免疫病、高血壓等，是遠期心血管事件的獨立預測因子，因其發(fā)病機制較為復雜，目前對其研究尚不確切[10-11]。動物實驗有助于理解CMVD的病理生理學機制并探索更好的治療方法，故建立一種可靠、可復制性強且經(jīng)濟快速的動物模型很有必要。

現(xiàn)階段CMVD 大鼠動物模型的建立方法[12-14]中導管介入法對操作者及建模工具要求較高，且導管費用昂貴，不易掌握，故開胸注射法仍是目前主流的造模方法。傳統(tǒng)開胸注射法均采取經(jīng)心尖部或主動脈根部注射，技術(shù)相對簡單，但手術(shù)過程中的創(chuàng)傷程度大，造模流程需要約1 h，且開胸需要氣管插管通氣，腹腔麻醉所用水合氯醛易導致大鼠室性心律失常，戊巴比妥鈉可導致大鼠呼吸抑制[15]，術(shù)中及術(shù)后死亡風險較高。為提高生存率，本研究手術(shù)操作在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，改為采取異氟烷氣體誘導麻醉。

開胸注射法通?？蛇x擇注入塑料微球、自體微血栓、月桂酸鈉[16-17]。在微循環(huán)障礙的病理過程中，血管內(nèi)皮細胞功能和結(jié)構(gòu)的異常具有重要地位[18-19]，而月桂酸鈉有強烈的內(nèi)皮損傷作用，可造成血管內(nèi)皮脫落、穿孔，形成血栓[9]。塑料微球通過物理方式導致冠狀動脈微血管栓塞，自體血栓通過模擬冠狀動脈內(nèi)斑塊破裂導致微血栓形成，這二者雖均可誘發(fā)心肌缺血及炎癥反應(yīng)，但無法模擬內(nèi)皮功能受損過程，故月桂酸鈉造成的化學損傷更符合CMVD 的發(fā)病機制[20-21]，更貼近臨床。

研究證實，微血栓的形成與月桂酸鈉的劑量有關(guān)[22]，目前實驗常用劑量為1 mg/kg 或2 mg/kg[23-25]?？紤]存在藥物劑量不足及未夾閉主動脈導致藥物未完全進入冠狀動脈致血管內(nèi)皮損傷較輕的可能性，故同時設(shè)置模型組2（二次損傷）和模型組3（夾閉主動脈根部）。本研究結(jié)果顯示，模型組1～3 均不會導致大血管病變，且模型組1 和模型組3 微血管堵塞程度及心功能受損程度均較模型組2 輕。此外，假手術(shù)組與空白組間心功能及心肌組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故擠出心臟所致?lián)p傷并不會導致心功能下降及微血栓形成。

需要注意的是，模型組2 的實驗方法對于操作者有如下要求：①需提高熟練度，以便在短時間內(nèi)完成操作；②術(shù)中需密切關(guān)注大鼠狀況，避免大鼠因長時間通氣功能障礙而死亡；③術(shù)中需根據(jù)大鼠情況及時調(diào)整麻醉藥物濃度，避免大鼠因在操作途中蘇醒掙扎或因心律失常、呼吸抑制而死亡；④術(shù)中心尖部注射藥物要求勻速、輕柔及緩慢，避免藥物作用時間過短，同時嚴格控制穿刺力度及深度。

本研究中3 種造模方法平均需要約10 min，較常規(guī)方法快捷，且均可成功導致微循環(huán)障礙，其中模型組2 微血管損傷及心功能受損最明顯，且造模時間短，死亡率低，成模穩(wěn)定，與常規(guī)方法結(jié)果基本一致，是較優(yōu)的一種造模方案，可廣泛應(yīng)用于CMVD 方面的研究，極大地提高實驗進程。研究者可根據(jù)所需微循環(huán)功能障礙的嚴重程度酌情調(diào)整給藥量。

本研究不足之處在于樣本量偏小，僅探索了加倍劑量的造模方案，且未嘗試更高濃度月桂酸鈉配比對微血管及冠狀動脈的損傷程度，因而未明確當劑量增加至何種水平時會導致大鼠的死亡率升高或損傷到大血管，后續(xù)實驗可在此基礎(chǔ)上進一步探索。另外，月桂酸鈉可能會導致全身微循環(huán)障礙，本研究未進行相關(guān)評估，后續(xù)實驗中應(yīng)注意觀察。