李磊 王靜 崔蘭鳳 呂思緣 郭雨菲 秦欣欣 王成祥

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，北京 100029；3.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院中醫(yī)科，北京 102218

近年來，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）的多重耐藥性顯著增加使得抗生素選擇受限，導(dǎo)致多重耐藥PA（multidrug resistantPseudomonas aeruginosa，MDRPA）慢性肺部感染患者死亡率升高[1-2]。而PA 可過度激活Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，導(dǎo)致促炎性細胞因子與抗炎細胞因子失衡，激發(fā)炎癥“瀑布樣效應(yīng)”，導(dǎo)致肺組織損傷[3]，這也是導(dǎo)致慢性肺部感染患者死亡率高的重要病理機制。黃芩苷是從黃芩中分離出來的黃芩主要活性成分，被應(yīng)用于多種炎癥疾病的治療[4-5]。基于此，本研究探討黃芩苷對MDRPA慢性肺部感染大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗用菌

實驗菌株由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科微生物室提供，菌株編號1607106。

1.2 實驗動物

選取SPF 級SD 大鼠32 只，雄性，6～8 周齡，體重180～220 g，實驗動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：1100112011099 12348；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物實驗在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生物安全實驗室進行，經(jīng)過實驗動物倫理委員會審批（2020D30）。

1.3 實驗藥物

黃芩苷（批號110715-200514）購自中國食品藥品監(jiān)督管理局，純度≥98%；哌拉西林他唑巴坦鈉（Wyeth Lederle S.R.L，批號：AKGD/11）由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科提供。

1.4 主要試劑與儀器

大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號：31063）、大鼠白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號：30194）、TLR4 抗體（Proteintech，貨號：19811-1-AP）、NF-κB（p65 亞基）（NF-κB p65 subanit，NF-κB p65）抗體（Proteintech，貨號：66535-1-Ig）。全自動多功能酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo）、電泳儀（JY300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（polymerase chain reaction，PCR）（CFX-96，Bio-RAD 公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥組和黃芩苷組，每組8 只。

1.5.2 模型建立 將MDRPA 菌液濃度設(shè)為1.5×108CFU/ml；采用1 ml 胰島素注射器滴入法制備MDRPA藻酸鹽包被體。使用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用經(jīng)口氣管插管法將MDRPA藻酸鹽包被體混懸液（0.1 ml/200 g）快速注入大鼠氣管中。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠肺組織勻漿培養(yǎng)出PA；感染慢性期可見肺組織實變、纖維增生、淋巴細胞浸潤[6]。

1.5.3 干預(yù)措施 按直接折算法計算大鼠與人的臨床等效劑量[7]。黃芩苷組給予0.8 g/（kg·d）黃芩苷灌胃（該濃度經(jīng)預(yù)實驗確定）；西藥組給予0.8 g/（kg·d）哌拉西林他唑巴坦鈉肌肉注射；空白組、模型組均給予與黃芩苷組等量的生理鹽水灌胃。四組均連續(xù)給藥14 d。

1.5.4 取材 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心（3500 r/min，10 min，離心半徑10 cm），取血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ∮曳谓M織于-80℃凍存，左肺組織置于4%的多聚甲醛中固定。

1.5.5 蘇木精-伊紅染色 將肺組織依次進行脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，染色。

1.5.6 ELISA 檢測四組血清細胞因子TNF-α、IL-10每組隨機取5 只大鼠的血清樣本進行TNF-α、IL-10檢測，具體實驗操作步驟按照ELISA 試劑盒說明書進行。

1.5.7 qPCR 檢測四組肺組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達 每組隨機取3 只大鼠的肺組織，使用TRIzol 法提取肺組織總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄；進行RT-PCR 反應(yīng)，應(yīng)用BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀記錄數(shù)據(jù)，反應(yīng)體系：PCR 上游引物2.0 μl、PCR 下游引物2.0 μl、cDNA2.0 μl、50×Rox參比染料0.4 μl、ddH2O 3.6 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，59℃退火/延伸60 s，共45個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組肺組織病理

空白組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。模型組可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁顯著增厚。黃芩苷組浸潤的炎癥細胞較少，肺泡壁較薄。見圖1。

圖1 四組肺組織病理（蘇木精-伊紅染色，200×）

2.2 四組血清TNF-α 和IL-10 比較

模型組血清TNF-α 高于空白組，IL-10 低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芩苷組血清TNF-α 低于模型組，IL-10 高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 四組血清TNF-α 和IL-10 比較（pg/ml，）

表2 四組血清TNF-α 和IL-10 比較（pg/ml，）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-10：白細胞介素-10

2.3 四組肺組織TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比較

模型組TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芩苷組TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 四組肺組織TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比較（）

表3 四組肺組織TLR4、NF-κB p65 mRNA 水平比較（）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。TLR4：Toll 樣受體4；NF-κB p65：核因子κB（p65 亞基）

3 討論

在囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病等患者中，PA可引起慢性肺部感染[8-11]。TLR4 是一類在固有免疫中起關(guān)鍵作用的膜結(jié)合模式識別受體[12-14]。PA 的內(nèi)毒素脂多糖被TLR4 識別并結(jié)合后，使磷酸化核因子抑制因子與NF-κB 分離，NF-κB p65 進入細胞核與DNA結(jié)合從而使促炎性細胞因子大量表達，激發(fā)炎癥“瀑布樣效應(yīng)”，導(dǎo)致組織損傷[15-16]。TNF-α 是促炎性細胞因子，促進NF-κB 的活化，并誘導(dǎo)其他促炎性細胞因子釋放[17]。IL-10 是抗炎細胞因子，具有抗炎作用[18-19]。近年來研究證實，抑制TLR4/NF-κB 通路能夠減輕肺組織損傷[20-21]。

中藥具有直接抑菌殺菌及調(diào)節(jié)機體平衡等作用[22-23]。有研究顯示，中藥對革蘭氏陰性菌的直接抑菌、殺菌作用較弱[24-25]。本研究顯示，黃芩苷可以減輕MDRPA慢性肺部感染大鼠肺組織炎性損傷，其抗炎機制可能與抑制TLR4/NF-κB 通路相關(guān)，值的臨床進一步深入探索。