王振偉 鄭黎靜

(黃河水利職業(yè)技術(shù)學院環(huán)境工程學院，河南 開封 475000)

線葉金雀花[AspalathusLinearis(Brum.f.) R. Dahlgren]是來源于南非的豆科植物，又名南非茶、博士茶，經(jīng)發(fā)酵后茶味道香甜，氣味淡雅，已于2014年被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準作為新食品資源[1]。線葉金雀花中主要的化學成分包括黃酮類、酚類、花色苷、有機酸和多糖類物質(zhì)[2]，具有強抗氧化活性[2]、保護心臟[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、增加骨密度[6]、降血糖[7]、輔助治療糖尿病[8]和抗焦慮[9]等作用?，F(xiàn)有研究[7，10]表明，線葉金雀花中主要的生物活性物質(zhì)是黃酮類化合物，主要由阿司巴汀、葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素、異槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等組成，具有較強的抗氧化活性，且阿司巴汀還具有降血糖、抗炎和抑菌作用。

大腸桿菌是常見的食源性條件致病菌之一，廣泛分布在各種食物中，嚴重危害著人們的身體健康[11]。目前，抑制食品貯藏期間大腸桿菌污染的主要方式是添加化學防腐劑，然而，隨著人們健康意識的增加，消費者越來越傾向于利用天然提取物作為防腐劑抑制大腸桿菌的污染[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能夠與受試細菌的細胞壁形成復(fù)合物，造成細菌生理功能障礙，從而起到抑菌的作用，同時由于天然黃酮類物質(zhì)具有安全、綠色、高效等特點，更容易被消費者接受。目前，黃酮類化合物最常用的提取方法為超聲輔助乙醇提取法，具有提取率高、提取時間短，操作簡便、成本低、產(chǎn)物易純化、設(shè)備要求低等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于鐵皮石斛花[14]、紅豆樹葉[15]、檸條錦雞兒[16]和橄欖葉[17]等多種植物資源總黃酮的提取。然而，有關(guān)線葉金雀花總黃酮提取工藝的進一步優(yōu)化及其對大腸桿菌抑菌活性的研究尚未見報道。

研究擬以線葉金雀花為研究對象，采用超聲輔助法對線葉金雀花總黃酮進行提取，利用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，在此基礎(chǔ)上，評估線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌的抑菌活性，并探討其作用機制，旨在為開拓線葉金雀花資源在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

線葉金雀花：短切Freshpak系列產(chǎn)品(發(fā)酵紅茶)，產(chǎn)地為南非，生產(chǎn)日期為2021年3月15日，保質(zhì)期24個月，扶風斯諾特生物科技有限公司；

大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7)：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；

蘆丁標準品(純度≥98%)：南京杜萊生物技術(shù)有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇：分析純，河南拓弘化工有限公司；

胰蛋白胨大豆瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：河南瑞倫特生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：BCE323-1CCN型，上海坤誠科學儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YXQ-100SII型，浙江明德儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：GT0303型，深圳市冠博科技實業(yè)有限公司；

紫外分光光度計：T2602S型，青島精誠儀器儀表有限公司；

透射電子顯微鏡：JEM-1400Flash型，日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的制作 參照鐘尉方等[18]的方法，所得標準曲線方程為y=13.231x+0.048 4(R2=0.987 7)。

1.2.2 線葉金雀花總黃酮提取及含量測定 取10 g經(jīng)干燥粉碎后的線葉金雀花粉末，按一定的乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲溫度、超聲時間進行提取，抽濾后得到線葉金雀花提取液，將提取液與相應(yīng)試劑進行反應(yīng)后測定510 nm 處溶液的吸光值，并按式(1)計算總黃酮提取率。

(1)

式中：

W——總黃酮提取率，%；

c——總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

v——濾液體積，mL；

M——線葉金雀花質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗 以10 g線葉金雀花粉末為基準，在乙醇體積分數(shù)50%，料液比1∶25 (g/mL)，超聲溫度70 ℃，超聲時間60 min的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為評價指標，考察乙醇體積分數(shù)(30%，40%，50%，60%，70%)、料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)]、超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)和超聲時間(20，40，60，80，100 min)對總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取率為響應(yīng)值，選用Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模型構(gòu)建四因素三水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化線葉金雀花總黃酮提取工藝。

1.2.5 大腸桿菌抑菌圈直徑(DIZ)測定 采用紙片擴散法[10]。

1.2.6 大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)Fei等[19]的方法稍作修改。將線葉金雀花總黃酮與滅菌的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(約50 ℃)在無菌24孔板中充分混合，使其終質(zhì)量濃度分別達到3.125，6.250，12.500，25.000，50.000，100.000 mg/mL，以0.1 mg/mL的氨芐青霉素為陽性對照。待培養(yǎng)基凝固后，向孔中央加入2 μL大腸桿菌菌懸液(106CFU/mL)，37 ℃培養(yǎng)24 h，以肉眼未見菌落長出的最小濃度定義為線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌的MIC。用濃度≥1 MIC的線葉金雀花總黃酮處理大腸桿菌菌懸液1 h，平板涂布，菌落無法生長的最低濃度被定義為MBC。

1.2.7 生長曲線測定 取25 μL大腸桿菌菌懸液(OD600 nm=0.2)，加入線葉金雀花總黃酮，使其終濃度分別為0(對照組)，0.5，1.0，1.5，2.0 MIC，并調(diào)整總體系達到250 μL，于37 ℃下培養(yǎng)，并構(gòu)建生長曲線[10]。

1.2.8 透射電子顯微鏡觀察 根據(jù)Li等[20]的方法稍作修改。分別用0，1，2 MIC的線葉金雀花總黃酮處理大腸桿菌菌懸液(OD600 nm=0.5)4 h，離心得到菌泥。將菌泥先后加入到2.5%戊二醛和1%鋨酸中固定2 h，每次固定后離心，并用磷酸緩沖液洗滌2次。用不同體積分數(shù)的乙醇(50%，70%，90%，100%)處理樣品10 min，包埋及雙重染色處理后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 除透射電子顯微鏡外所有試驗均重復(fù)3次，采用Office 2019處理單因素試驗數(shù)據(jù)，利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)>50%時，乙醇與線葉金雀花總黃酮之間的極性差不再增加，反而會導(dǎo)致其他溶性雜質(zhì)的溶解，增加了與黃酮溶出的競爭，導(dǎo)致總黃酮提取率下降[14]。當料液比<1∶25 (g/mL)時，總黃酮提取率隨料液比的增大而增加；當料液比>1∶25 (g/mL)，超聲波對線葉金雀花的破碎及空化作用減弱，提取率下降[15]。當超聲溫度>70 ℃時，過高的溫度會破壞黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致總黃酮提取率下降[16]。當超聲時間>60 min時，長時間的超聲作用也會破壞黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性，并增加溶液黏度和傳質(zhì)阻力，不利于黃酮類物質(zhì)的溶出[17]。綜上，超聲輔助乙醇法提取線葉金雀花總黃酮的適宜工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%，料液比1∶25 (g/mL)，超聲溫度70 ℃，超聲時間60 min。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲溫度和超聲時間為因素，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken模型構(gòu)建四因素三水平的響應(yīng)面試驗，因素水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸擬合，構(gòu)建優(yōu)化線葉金雀花總黃酮提取率的回歸方程：

Y=2.42+0.091A+0.046B+0.10C+0.094D-0.023AB+0.040AC+0.020AD+0.065BC+0.060BD+0.032CD-0.21A2-0.14B2-0.11C2-0.18D2。

(2)

由表3可知，模型極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明模型擬合度與置信度符合要求，可用于線葉金雀花總黃酮提取率的預(yù)測和分析。顯著性分析檢驗結(jié)果顯示，一次項A、C、D，二次項A2、B2、C2和D2對總黃酮提取率影響極顯著(P<0.01)，一次項B，交互項BC和BD對總黃酮提取率影響顯著(P<0.05)。由F值可知，各因素對總黃酮提取率的影響順序為超聲溫度>超聲時間>乙醇體積分數(shù)>料液比。

表3 方差分析?

2.2.2 各因素交互作用 由圖2可知，料液比和超聲溫度、料液比和超聲時間相互作用形成的響應(yīng)面坡度陡峭，說明料液比和超聲溫度、料液比和超聲時間的交互作用明顯，對線葉金雀花總黃酮提取率影響顯著(P<0.05)，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面回歸模型預(yù)測可知，線葉金雀花總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)52.75%，料液比1∶27.01 (g/mL)，超聲溫度77.12 ℃，超聲時間68.15 min，該條件下預(yù)測線葉金雀花總黃酮提取率為2.50%。為方便試驗操作，最終確定最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)53%，料液比1∶27 (g/mL)，超聲溫度77 ℃，超聲時間68 min，此條件下實測線葉金雀花總黃酮提取率為2.46%(n=3)，與預(yù)測值相近，且高于Bramati等[21]的水提法(提取率為0.55%)，說明超聲輔助乙醇提取法提取線葉金雀花總黃酮具有一定的優(yōu)越性。

圖2 各因素交互作用對線葉金雀花總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

表4 線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌的抑菌試驗?

2.3 線葉金雀花總黃酮的抑菌活性

2.3.1 DIZ、MIC和MBC 由表4可知，線葉金雀花總黃

酮對大腸桿菌的DIZ、MIC和MBC值分別為(11.4±0.21) mm、12.5 mg/mL和25 mg/mL。目前，黃酮類化合物已被證實對大腸桿菌具有明顯的抑制作用，如：頭花蓼中總黃酮對大腸桿菌的MIC和MBC值分別為7.3，7.9 mg/mL[22]；藜麥種子總黃酮對大腸桿菌的MIC值為32 mg/mL[23]；紫葉李皮總黃酮對大腸桿菌的MIC和MBC分別為12.6，25.2 mg/mL[24]；苦蕎麩皮黃酮提取物對大腸桿菌的MIC和MBC值分別為25，50 mg/mL[25]。與上述黃酮類物質(zhì)相比，線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌的抑制效果處中上等水平，可用作天然防腐劑的開發(fā)。

2.3.2 對大腸桿菌生長曲線的影響 由圖3可知，在線葉金雀花總黃酮的作用下，大腸桿菌的生長被顯著抑制(P<0.05)，對數(shù)生長期消失，且線葉金雀花總黃酮質(zhì)量濃度越高，抑菌效果越好。當作用濃度為2 MIC時，大腸桿菌的生長被完全抑制，說明線葉金雀花總黃酮能夠有效抑制大腸桿菌的生長繁殖，并呈濃度依賴效應(yīng)，與胎菊水提物抑制大腸桿菌[11]，莧菜粗提物抑制金黃色葡萄球菌[12]和丁香酸抑制阪崎克羅諾桿菌[26]的生長曲線相似。

圖3 線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌生長曲線的影響

2.3.3 透射電子顯微鏡分析 由圖4可知，正常狀態(tài)下大腸桿菌呈桿狀，胞內(nèi)細胞液飽滿，細胞形態(tài)正常。經(jīng)1，2 MIC的線葉金雀花總黃酮處理后，大腸桿菌的細胞形態(tài)發(fā)生了嚴重損傷，包括細胞塌陷、細胞壁和細胞膜分離、細胞液外泄、細胞破碎等現(xiàn)象，且上述細胞形態(tài)學損傷會隨線葉金雀花總黃酮作用濃度的增加而加劇，表明線葉金雀花總黃酮能夠通過破壞大腸桿菌的細胞形態(tài)達到抑制其生長的目的。這與胎菊水提物抑制大腸桿菌、茶多酚抑菌阪崎克羅諾桿菌、橄欖油多酚抑制蠟樣芽孢桿菌的過程一致，且細胞液外泄是胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子含量減少的重要原因之一[11, 19-20]。此外，天然產(chǎn)物對食源性致病菌的抑菌作用是否可逆與受試細菌的細胞形態(tài)受損程度有關(guān)，如果受試細菌只是細胞表面形成氣孔或囊泡，則通過再培養(yǎng)，受試細胞仍能夠正常生長繁殖，相比之下，如果受試細菌出現(xiàn)細胞液外泄，則再培養(yǎng)也無法使細菌正常生長[20,27]。綜上，在線葉金雀花總黃酮的作用下，大腸桿菌的細胞形態(tài)發(fā)生了不可逆的損傷。

圖4 線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響

3 結(jié)論

研究了線葉金雀花總黃酮的最佳超聲提取工藝參數(shù)及其對大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，線葉金雀花總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)53%，料液比1∶27 (g/mL)，超聲溫度77 ℃，超聲時間68 min，此工藝條件下線葉金雀花總黃酮的提取率為2.46%。抑菌試驗結(jié)果顯示，線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌的抑菌圈直徑、最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為(11.40±0.21) mm、12.5 mg/mL和25 mg/mL。此外，不同質(zhì)量濃度的線葉金雀花總黃酮對大腸桿菌具有良好的抑制作用，并可對受試細菌造成嚴重的細胞形態(tài)學損傷。后續(xù)將進一步對線葉金雀花總黃酮進行提純，并分析其活性物質(zhì)組成，以期能夠應(yīng)用于食品防腐中。