范 哲，顧廣源

(魯南技師學(xué)院， 山東 臨沂 276000)

1 引言

芒果呈不規(guī)則的橢圓狀，果肉肥厚，有核，口感細(xì)膩清甜，有“熱帶水果之王”的稱(chēng)號(hào)[1，2]。芒果中含有大量的糖類(lèi)、維生素、礦物質(zhì)、多種酶[3，4]等，其中超氧化物歧化酶含量較為豐富，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶[5～7]。SOD是一種特殊的酶[8～11]，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有清除機(jī)體超氧陰離子、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[12，13]的作用。

目前，芒果的研究主要集中在育種、簡(jiǎn)單粗加工，少有文獻(xiàn)報(bào)道其抗氧化性。鑒于此，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究SOD提取的最適條件[14～16]。采用單因素實(shí)驗(yàn)，通過(guò)設(shè)置提取溶劑、料液比、浸提時(shí)間、超聲功率及時(shí)間5個(gè)單因素[17～19]，得到最優(yōu)值后利用正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳提取工藝[20，21]，為芒果的開(kāi)發(fā)利用提供方向。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

2.1.1 儀器

KQ-A100DE型數(shù)控超聲波清洗器，KHB-ST360型自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，DWF-100型電動(dòng)植物粉碎機(jī)，冰箱、離心機(jī)、分析天平、離心管、錐形瓶、移液槍等。

2.1.2 材料及試劑

芒果、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、SOD檢測(cè)試劑盒(雷根生物)等。

2.1.3 PBS試劑的配制

母液：試劑一：0.05 mol/L Na2HPO4·12H2O ,試劑二：0.05 mol/L NaH2PO4·2H2O (表1)。

表1 不同pH值PBS的配制 mL

2.1.4 SOD試劑盒(NBT核黃素微板法)

NBT工作液的制備及SOD試劑盒加樣表見(jiàn)表2、表3。

表2 NBT工作液的制備 μL

表3 SOD試劑盒加樣 μL

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 材料處理

取市售芒果洗凈削皮去核，果肉在粉碎機(jī)打碎，經(jīng)多次紗布過(guò)濾至無(wú)纖維等肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)，濾紙進(jìn)行過(guò)濾。濾液至離心管，離心去除雜蛋白和沉淀，得上清液。

2.2.2 SOD的分離提取及純化

2.2.2.1 提取溶劑pH值的篩選

取上清液5 mL于試管中，加入等體積的提取溶劑，0.5 h的時(shí)間浸提，提取溶劑為以下 6 種：pH=7.0、pH=7.2、pH=7.4、pH=7.6、pH=7.8、pH=8.0的0.05 mol/L PBS緩沖液。浸提0.5 min后，離心取上清液。加入等體積的預(yù)冷丙酮4 ℃條件下冷藏過(guò)夜，有白色絮狀物質(zhì)和膠狀物質(zhì)析出，過(guò)濾去除雜質(zhì)。離心取上清液，得粗酶液。

2.2.2.2 溶劑的料液比

取上清液5 mL于試管中，以pH為7.2的0.05 mol/L的PBS作為提取溶劑,料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。浸提0.5 h后,離心除去沉淀。取上清液于試管中，預(yù)冷丙酮4℃低溫過(guò)夜,離心取上清液。

2.2.2.3 提取時(shí)間的篩選

取上清濾液3 mL于試管中，以1∶5的比例加入0.05 mol/L PBS緩沖液浸提：分別浸提0.5 h、1 h、 1.5 h、2 h、2.5 h。

2.2.2.4 超聲功率篩選方法

取上清濾液5 mL于多個(gè)試管中，分別加入0.05 mol/L PBS緩沖液進(jìn)行超聲。分別在400 W、500 W、600 W、700 W、800 W、900 W、1000 W的條件下超聲10 min。對(duì)7組待測(cè)樣離心除渣，取上清液，加入等體積預(yù)冷的丙酮，混合后放在冰箱4 ℃的條件下低溫過(guò)夜。過(guò)濾再進(jìn)行離心,取上清液。

2.2.2.5 超聲時(shí)間的篩選方法

取上清濾液5 mL于多個(gè)試管中，分別加入0.05 mol/L PBS緩沖液后超聲。超聲功率900 W，超聲時(shí)間10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min、60 min。

2.2.3 SOD的鑒定

將SOD試劑盒中各試劑按照說(shuō)明書(shū)加入點(diǎn)樣板后，分別加入20 uL待測(cè)樣液作為實(shí)驗(yàn)組。將待測(cè)液換為SOD酶溶液進(jìn)行點(diǎn)樣作為光照對(duì)照組。強(qiáng)光直射30 min，出現(xiàn)明顯的顏色變化，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)每個(gè)單因素試驗(yàn)，得到相對(duì)較優(yōu)的提取條件，進(jìn)行多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇較為敏感的水平和因素(表4、表5)[13]。

表4 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平

表5 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素

2.2.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理及圖表制作均采用Excel和SPSS等軟件整理。

3 結(jié)果與分析

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1.1 提取溶劑pH值的確定

pH值為7.2的PBS溶液OD值最大，后隨著pH值的增加，OD值反而越來(lái)越小。所以pH值為7.2的PBS為較好的提取溶劑,并用于后續(xù)單因素試驗(yàn)(圖1)。

圖1 提取溶劑pH對(duì)SOD值的影響

3.1.2 提取料液比的確定

料液比在1∶1～1∶5時(shí)，隨著浸取液的增加OD值不斷增加，并在1∶5處得到最大值0.411。料液比為1∶5～1∶7的OD值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可選擇在料液比為1∶5或1∶6。為節(jié)約試劑,可選擇料液比1∶5用于后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 料液比對(duì)SOD值的影響

3.1.3 浸提時(shí)間的確定

從圖3中可得，浸提時(shí)間從0.5 h到1.5 h，OD值不斷向上增長(zhǎng)，在1.5 h出現(xiàn)最高點(diǎn)，值為0.485，1.5 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以浸提時(shí)間選擇1.5 h。

圖3 溶劑浸提時(shí)間對(duì)SOD值的影響

3.1.4 超聲功率的確定

隨著超聲功率的升高OD值出現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)超聲機(jī)械振動(dòng)可加快分子間的運(yùn)動(dòng)速度和頻率，增加提取溶劑的提取效果率。但隨著超聲功率升高到900 W，OD值下降。綜上，在900 W處有最大值,為最優(yōu)的超聲提取功率(圖4)。

圖4 超聲功率對(duì)SOD值的影響

3.1.5 超聲時(shí)間的確定

隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值呈上升趨勢(shì)，30 min達(dá)到最大值0.469，之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。因此選擇超聲時(shí)間30 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖5)。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)SOD值的影響

3.2 正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件

正交實(shí)驗(yàn)得出SOD的最佳提取條件為：以pH值為7.1，0.05 mol/L的PBS緩沖液為提取溶劑，在料液比為1∶4，用超聲進(jìn)行輔助提取，超聲時(shí)間和功率為28 min、800 W。正交試驗(yàn)得到最佳組合為A1B1C1D1以及各因素的關(guān)鍵性對(duì)比為D(超聲時(shí)間)>B(料液比)>A(提取溶劑)>C(超聲功率)(表6)。

表6 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素結(jié)果

4 結(jié)論

在芒果SOD的提取及抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)中，考察了提取溶劑pH值、超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、浸提時(shí)間5個(gè)影響因素。正交實(shí)驗(yàn)得到最佳的組合為pH值為7.1，0.05 mol/L的PBS緩沖液為提取溶劑，料液比為1∶4，超聲時(shí)間和功率為28 min、800 W進(jìn)行輔助提取。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到最佳的提取條件，為芒果SOD的提取提供了參考。