鄧林林 張嘯 高儀 龔園其 藍(lán)海兵

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（南昌 330000）

膿毒癥是一種由感染引起全身性炎癥反應(yīng)的危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征［1-2］。該病極易進(jìn)展為膿毒性休克，一旦發(fā)病，發(fā)展速度極快，且患者預(yù)后較差，病死率極高［3-4］。其中急性腎損傷是該病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，病死率也極高。目前，該病的發(fā)病率還在逐年遞增，因此研究有效的治療手段十分關(guān)鍵，微小RNA（microRNA，miR）是一類非編碼RNA，可以調(diào)控基因表達(dá)。有研究［5］表明，miR-216a 可以廣泛的表達(dá)于心、肝、肺、腎等組織中，并且與急性胰腺炎導(dǎo)致的胰腺損傷存在密切的聯(lián)系，且在對(duì)于炎癥的控制方面具有特異性，其可以對(duì)相關(guān)炎癥基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，在炎癥的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。但是與膿毒癥急性腎損傷的關(guān)系還有待探討，本文推測(cè)其可能作為急性損傷診斷的標(biāo)志物。除此之外，有研究［6-7］指出，當(dāng)人體處于缺血缺氧的狀態(tài)時(shí)，炎癥信號(hào)通路就會(huì)被激活，從而產(chǎn)生炎性因子導(dǎo)致急性腎損傷發(fā)病，而NF-κB 就是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的常見通路；且此通路與膿毒癥大鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)有一定的聯(lián)系［8］。但是miR-216a 是否可以調(diào)控NF-κB 改善膿毒癥大鼠急性腎損傷，還并不明確。因此，本文以膿毒癥大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，制備膿毒癥模型，觀察其炎癥因子以及生化指標(biāo)的表達(dá)，初步探討miR-216a 對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取40 只在9 周齡左右的SD 雄性大鼠，體質(zhì)量260 g 左右，購自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度：27 ℃左右；濕度：55%左右，自由進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后將其隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、miR-NC 組、miR-216a 組，每組各10 只。實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2017009）。

1.1.2 儀器與試劑 TRIzol RT RNA 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）；miR-216a 模擬物及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）模擬物（上海吉?jiǎng)P公司）；PCR 儀、電泳儀、酶標(biāo)儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；所需抗體（美國(guó)Thermo 公司）；組織勻漿機(jī)（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 假手術(shù)組大鼠僅僅在開腹后分離兩腎，然后關(guān)閉即可，其余大鼠參照文獻(xiàn)［9］，以盲腸結(jié)扎穿孔法進(jìn)行造模：對(duì)所有大鼠均進(jìn)行麻醉，然后開腹，模型組和miR-NC 組、miR-216a 組大鼠首先脫毛、消毒，然后將右腎蒂及輸尿管進(jìn)行分離，然后將其結(jié)扎，左腎分離后采用夾鉗將動(dòng)脈閉合30 min 左右，最后進(jìn)行縫合。miR-NC 組、miR-216a 組在造模成功后大鼠尾部分別注射5 μL 的miR-NC、miR-216a，模型組和假手術(shù)組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射3 d。第4 天麻醉大鼠，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)豎毛、蜷縮懶動(dòng)、呼吸急促、進(jìn)食減少、精神萎靡、眼角分泌物增多、保護(hù)性反射減弱等則表示造模成功，本實(shí)驗(yàn)所有大鼠均造模成功。

1.2.2 HE 染色觀察大鼠組織病理變化先將大鼠麻醉，仰臥固定，打開腹部暴露臟器，小心摘取腎臟后，用生理鹽水充分沖洗后再固定，流水沖洗并采用酒精脫水，再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑中，放入保溫箱中。待石蠟完全浸入組織塊后包埋，連續(xù)5 μm 切片，進(jìn)行染色，然后采用顯微鏡觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)改變。

1.2.3 PCR 檢測(cè)大鼠腎組織中miR-216a 表達(dá) 提取組織總RNA，然后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增后根據(jù)試劑盒進(jìn)行PCR 檢測(cè)。檢測(cè)miR-216a 表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 生化分析儀檢測(cè)各組大鼠生化指標(biāo)水平 抽取大鼠靜脈血液2 mL，采用生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中血肌酐（blood creatinine，Scr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）以及腎損傷分子-1（kidney damage molecule-1，KIM-1）水平。

1.2.5 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清炎癥因子水平 將各組大鼠靜脈血液迅速注入EDTA 試管中混勻，離心后置于-80 ℃環(huán)境中待檢，采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)各組組織的NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取組織總蛋白進(jìn)行測(cè)定，加入SDS-PAGE 凝膠后進(jìn)行電泳，分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜用BSA 封閉PVDF 膜1 h，脫脂封閉后加入NF-κB p65、p-NF-κB p65 抗體；吸盡一抗孵育時(shí)的洗滌液后加入稀釋好的二抗慢慢搖動(dòng)；再次搖動(dòng)洗滌，然后凝膠成像，計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析；兩兩之間采用LSD-t檢驗(yàn)多重比較；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟組織病理改變 假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無異常；模型組和miR-NC 組腎組織伴有炎性浸潤(rùn)、腎間質(zhì)加寬；miR-216a 組炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象以及腎小球病變情況有所緩解，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化（200×）Fig.1 Histopathological changes in the kidney of each group of rats（200×）

2.2 測(cè)定組織中miR-216a 表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組、miR-NC 組腎組織miR-216a 表達(dá)水平較低，與miR-NC組相比，miR-216a組腎組織的miR-216a 表達(dá)水平較高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功，見表2。

表2 各組大鼠腎組織中miR-216a 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

表2 各組大鼠腎組織中miR-216a 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05

分組假手術(shù)組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 miR-216a 1.02±0.05 0.52±0.12*0.50±0.08*3.75±0.54*309.005＜0.001

2.3 測(cè)定各組大鼠腎組織生化指標(biāo) 與假手術(shù)組相比，模型組、miR-NC 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1水平較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腎組織中生化指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

表3 各組大鼠腎組織中生化指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05

分組假手術(shù)組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 Scr（μmol/L）30.52±3.69 52.67±4.48*52.36±4.03*40.03±2.57*80.763＜0.001 BUN（mmol/L）7.63±1.69 22.05±3.69*21.08±3.74*13.48±2.58*49.862＜0.001 KIM-1（ng/L）21.07±3.05 63.17±8.63*63.47±8.41*39.74±6.12*87.393＜0.001

2.4 測(cè)定大鼠血清炎性細(xì)胞因子 與假手術(shù)組相比，模型組、miR-NC 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平較低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

表4 各組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05

分組對(duì)照組模型組miR-NC 組miR-226a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 TNF-α（ng/mL）45.63±6.17 132.05±15.08*133.25±16.47*69.36±9.04*127.845＜0.001 IL-6（ng/mL）28.39±5.95 95.33±10.32*96.01±10.41*54.04±8.41*136.835＜0.001 IL-1β（ng/mL）40.17±6.28 106.47±10.45*105.85±10.99*71.74±9.54*117.705＜0.001

2.5 測(cè)定大鼠腎組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組、miR-NC 組大鼠腎組織中蛋白表達(dá)較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠腎組織中蛋白表達(dá)較低（P＜0.05），見表5，圖2、3。

圖2 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of various groups of rats

表5 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

表5 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05

分組假手術(shù)組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 NF-κB p65 1.05±0.06 2.57±0.17*2.55±0.19*1.38±0.08*333.569＜0.001 p-NF-κB p65 1.34±0.15 2.89±0.26*2.88±0.27*1.54±0.10*160.794＜0.001

圖3 NF-κB 信號(hào)通路作用圖Fig.3 NF-κB signaling pathway action diagram

3 討論

膿毒癥是由各種細(xì)菌、真菌等微生物入侵到機(jī)體后引發(fā)的炎癥反應(yīng)，是一種全身性的反應(yīng)，該病在發(fā)病過程中，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量促炎因子從而改善炎癥反應(yīng)，但如果增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的因子和減輕炎癥反應(yīng)的因子發(fā)生抗衡，就會(huì)損害機(jī)體；據(jù)研究［10］發(fā)現(xiàn)，大約30% ～50%的膿毒癥患者會(huì)發(fā)生膿毒癥急性腎損傷，且非常常見，而且該并發(fā)癥具有病情危急、臨床治療效果不明顯、病死率極高等特點(diǎn)。盡管目前許多抗生素都在不斷升級(jí)，治療手段也在不斷改善，但是該病的治療成本也在不斷增長(zhǎng)，且病死率依舊沒有下降［11］。有研究已證實(shí)，miR-216a 已被證明與包括肺癌、乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)病以及病情進(jìn)展有關(guān)。除此之外，還有研究表明miR-216a 可以調(diào)控Ybx1-框結(jié)合蛋白1 的表達(dá)在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到參與作用，這提示miR-216a 或許也可以在急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展中起到一定的調(diào)控作用［12-13］。且萬笑笑［14］已經(jīng)研究證實(shí)，miR-216a 可以通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路抑制缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞急性腎損傷。這為miR-216a 可以參與膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展這一結(jié)論增加了一絲可信度。因此，本文通過研究SD 大鼠，對(duì)其進(jìn)行膿毒癥模型建造，并對(duì)miR-216a 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-216a 在模型組中的表達(dá)較低，說明低表達(dá)的miR-216a 會(huì)增加大鼠腎組織的損傷，影響腎功能。此外，有研究提示，NF-κB 通路對(duì)膿毒癥有調(diào)控作用。因此，本文就miR-216a 是否可以調(diào)控NFκB 信號(hào)通路作用于膿毒癥大鼠進(jìn)行分析。

在本研究中，首先觀察了各組大鼠腎組織的病理學(xué)變化，結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無異常；模型組和miR-NC 組腎組織伴有炎性浸潤(rùn)、腎間質(zhì)加寬；miR-216a 組炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象以及腎小球病變情況有所緩解。這說明miR-216a 在膿毒癥急性腎損傷的并且進(jìn)展中扮演著抑癌的角色，進(jìn)一步證實(shí)其過表達(dá)對(duì)腎組織有一定的保護(hù)作用。Scr、BUN 是判斷腎功能損害的重要指標(biāo)，在急性腎損傷中會(huì)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，KIM-1 也是該病的重要標(biāo)志因子，在早期水平較高［15］。在本研究結(jié)果中，顯示模型組、miR-NC 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較假手術(shù)組升高，miR-216a 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較miR-NC 組降低。這進(jìn)一步提示過表達(dá)的miR-216a 可以降低膿毒癥急性腎損傷的腎功能損害程度。眾所周知［16］，TNF-α 和IL-1β 是反應(yīng)機(jī)體炎癥的重要指標(biāo)，也是該病在發(fā)展過程中單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要因子；而IL-6 是膿毒癥中關(guān)鍵促炎因子，可以激活某些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)膿毒癥等病理?xiàng)l件下的多種細(xì)胞因子［17］。在本研究的ELISA 實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠血清炎性因子水平較高，而與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清炎性因子水平較低。說明，miR-216a 可以減少TNF-α，IL-6 以及IL-1β 的分泌，抑制炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，緩解炎癥癥狀。提示過表達(dá)的miR-216a 在疾病進(jìn)展過程中可以通過抑制炎癥反應(yīng)來保護(hù)腎臟。

王彬等［18］指出，在實(shí)驗(yàn)性重度急性胰腺炎組織中的TLR4、NF-κB p65 表達(dá)變化與腎損傷嚴(yán)重程度和促炎因子的變化一致，且認(rèn)為某種激酶的負(fù)調(diào)控通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷［19］。并且研究［20］發(fā)現(xiàn)NFκB 通路在膿毒癥中有重要的參與作用，且與炎性因子水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；研究還指出，當(dāng)NF-κB 被激活后，進(jìn)而會(huì)抑制促炎因子的表達(dá)；當(dāng)正反饋調(diào)節(jié)與負(fù)反饋調(diào)節(jié)失衡時(shí)，也就是促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡時(shí)，就會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，甚至是膿毒癥，最終導(dǎo)致多功能障礙綜合征［21-22］。而在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了與以上研究基本一致的結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組、miR-NC 組大鼠腎組織中NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)較高，而與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠腎組織中通路相關(guān)蛋白表達(dá)較低。此外，在膿毒癥中，由于外來致病菌的感染，LPS 與TLRs 結(jié)合以后，經(jīng)過信號(hào)通路的傳導(dǎo)最終激活NF-kB 的轉(zhuǎn)錄，釋放大量的促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-P、IL-1、IL-6、IL-10 等因子，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終影響疾病的預(yù)后。而本研究miR-216a 可以減少炎癥因子釋放，抑制NF-κB通路，這提示miR-216a 對(duì)膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)作用是通過抑制NF-κB 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。其抗炎機(jī)制可能是通過其抗炎機(jī)制可能是降低NF-κB p65 表達(dá)，抑制NF-κB 信號(hào)通路活化，降低炎性因子TNF-α，IL-6，IL-1β 分泌。

綜上所述，過表達(dá)miR-216a 可能是通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路，抑制膿毒癥大鼠炎癥因子的釋放，阻斷炎癥因子的合成與釋放，進(jìn)而保護(hù)腎臟。miR-216a 可作為膿毒癥急性腎損傷中的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，對(duì)臨床診斷及療效判定等方面具有重要的意義。但是是否有其他miRNA 參與疾病進(jìn)程尚不清楚，需要深入研究。