邴伯東，孟慶春，李川

(1.承德市婦幼保健院婦科，承德 067000；2.灤平縣中醫(yī)院心內(nèi)科，承德 068250；3.灤平縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，承德 068250)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜之外的部位出現(xiàn)生長(zhǎng)浸潤(rùn)、多次重復(fù)出血形成包塊引起疼痛的婦科疾病。EMs患者的子宮內(nèi)膜組織包括在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜，在位內(nèi)膜是患者子宮內(nèi)的內(nèi)膜，異位內(nèi)膜是已經(jīng)轉(zhuǎn)移到宮腔以外的內(nèi)膜。在位內(nèi)膜的細(xì)胞凋亡、增殖等異常，可導(dǎo)致異位病灶的形成；雌激素分泌增多、炎癥、免疫、遺傳等多種因素均能導(dǎo)致該疾病的發(fā)生，臨床癥狀主要表現(xiàn)為小腹疼痛、痛經(jīng)、不孕等，在育齡期女性較為常見(jiàn)，甚至部分患者會(huì)逐漸演變成卵巢癌，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全[1]。因此，研究與EMs有關(guān)的標(biāo)志物，對(duì)EMs的早期防治具有重要意義[2-3]。

叉頭框D1(FOXD1)作為叉頭框(FOX)家族成員之一，其在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，具有多種生物學(xué)功能，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育等[4-5]。Zhang等[6]研究結(jié)果表明，宮頸癌患者FOXD1呈高表達(dá)，具有促進(jìn)癌癥發(fā)生的作用，然而關(guān)于FOXD1在EMs中發(fā)揮的作用尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為21～25 nt，可調(diào)控多種基因的表達(dá)，目前，已知有高達(dá)2 000個(gè)miRNA在機(jī)體各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。報(bào)道稱，miRNA在EMs患者的子宮內(nèi)膜組織的修復(fù)、血管形成、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外間質(zhì)形成等生理病理過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-9]。研究表明，miR-216b-5p作為miRNA的一員，其異常表達(dá)與卵巢癌[10]、宮頸癌[11]等疾病的發(fā)生有關(guān)，但關(guān)于miR-216b-5p在EMs中發(fā)揮的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1、miR-216b-5p表達(dá)水平變化，探討二者的臨床意義。

資料與方法

一、研究對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為EMs；無(wú)免疫性疾??；無(wú)急性炎癥；無(wú)雌激素依賴性疾??；近期未接受過(guò)內(nèi)分泌治療；患者知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：使用激素類藥物治療；合并卵巢癌等惡性腫瘤；合并甲狀腺疾??；合并糖尿病、多囊卵巢綜合征等；臨床資料不全。

另選取在我院因子宮肌瘤進(jìn)行手術(shù)的患者作為對(duì)照組(185例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為子宮肌瘤；患者知情同意；無(wú)免疫性疾?。慌懦龢?biāo)準(zhǔn)與研究組一致。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑和儀器

兔抗人FOXD1單克隆抗體(ab129324，Abcam，美國(guó))；DAB染色試劑盒(CD-103172GM，武漢純度生物)；山羊抗兔IgG二抗(ZF-0511，北京中杉金橋)；miR-216b-5p、U6、FOXD1、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235，Leica，美國(guó))；生物顯微鏡(SPCC-200，Nikon，日本)；PCR基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystems，美國(guó))。

三、研究方法

1.樣本采集：取腹腔鏡手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為EMs患者的異位子宮內(nèi)膜組織(內(nèi)異囊腫壁)和在位子宮內(nèi)膜組織(研究組)，取因子宮肌瘤進(jìn)行手術(shù)患者的子宮內(nèi)膜組織(對(duì)照組)；將內(nèi)膜組織置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

在妊娠前半期，支持胎兒腦神經(jīng)發(fā)育的甲狀腺激素主要來(lái)自母體。妊娠期患有甲狀腺疾病的患者也要攝取足夠的碘，食用加碘食鹽是最好的方法?；加凶陨砻庖呒谞钕傺缀图谞钕俟δ軠p退的妊娠婦女，還要定期監(jiān)測(cè)甲狀腺功能。

2.免疫組化法檢測(cè)組織中FOXD1蛋白的表達(dá)：取組織標(biāo)本進(jìn)行多聚甲醛固定，然后石蠟包埋，使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)制作4 μm石蠟切片，將其編碼并烘干，使用二甲苯、檸檬酸緩沖液進(jìn)行脫蠟、修復(fù)抗原等一系列操作后，加入1∶500稀釋的兔抗人FOXD1一抗，4℃過(guò)夜，陰性對(duì)照組使用稀釋液代替；使用PBS進(jìn)行3次清洗，加入山羊抗兔lgG二抗25℃孵育1 h，DAB染色，蘇木素復(fù)染；使用生物顯微鏡高倍視野(×400)觀察切片。

結(jié)果判定[12]：以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積評(píng)估FOXD1蛋白表達(dá)：≤3分為表達(dá)陰性，>3分為表達(dá)陽(yáng)性(表1)。

表1 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)組織FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的相對(duì)表達(dá)量：取子宮內(nèi)膜組織研磨，加入1 ml Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))完全裂解提取總RNA，測(cè)定RNA純度和濃度，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR對(duì)FOXD1 mRNA、miR-216b-5p進(jìn)行擴(kuò)增。FOXD1 mRNA的qRT-PCR反應(yīng)條件為96℃ 5 min；60℃ 3 min；55℃ 60 s。miR-216b-5p的qRT-PCR反應(yīng)條件為94℃ 8 min；95℃ 30 s；55℃ 60 s。FOXD1、miR-216b-5p、GAPDH、U6的上下游引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCT法分析FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的表達(dá)水平。

表2 qRT-PCR引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料比較

本研究共納入188例EMs患者為研究組，根據(jù)修正的美國(guó)生育協(xié)會(huì)(r-AFS)分期標(biāo)準(zhǔn)[13]Ⅰ～Ⅱ期95例、Ⅲ～Ⅳ期93例，年齡20～45歲。另納入185例同期因子宮肌瘤進(jìn)行手術(shù)的非EMs患者作為對(duì)照組，年齡21～45歲。

兩組間年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕產(chǎn)史、不孕、痛經(jīng)等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較

研究組分別取材在位子宮內(nèi)膜組織(在位組)和異位子宮內(nèi)膜組織(異位組)。研究組在位和異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；研究組異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)(表4、圖1)。

三、兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p表達(dá)水平比較

研究組在位和異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-216b-5p表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；研究組異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達(dá)水平顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)，miR-216b-5p表達(dá)水平顯著低于在位子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)(表5、圖2)。

表4 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較

圖1 FOXD1蛋白在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×100)

表5 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相對(duì)表達(dá)量的電泳圖

四、EMs組織FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的相關(guān)性分析

生物信息學(xué)TargetScan網(wǎng)站顯示，F(xiàn)OXD1和miR-216b-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

圖3 FOXD1與miR-216b-5p結(jié)合位點(diǎn)圖

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中，miR-216b-5p表達(dá)水平與FOXD1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.369，P<0.05)(圖4)。

圖4 FOXD1 mRNA、miR-216b-5p相關(guān)性分析圖

五、FOXD1 mRNA和miR-216b-5p水平對(duì)EMs的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA診斷EMs發(fā)生的ROC曲線下面積(AUC)為0.730(0.677～0.784)，敏感度為80.5%，特異性為68.6%，截?cái)嘀禐?.000；miR-216b-5p診斷EMs發(fā)生的AUC為0.828(0.783～0.872)，敏感度為82.7%，特異性為85.1%，截?cái)嘀禐?.409；二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC為0.847(0.805～0.889)，敏感度為88.1%，特異性為68.1%。與FOXD1 mRNA單獨(dú)檢測(cè)相比，二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC更高(Z=3.359，P=0.001)；與miR-216b-5p單獨(dú)檢測(cè)相比，二者聯(lián)合診斷EMs發(fā)生的AUC無(wú)顯著差異(Z=0.597，P=0.551)(圖5)。

圖5 相關(guān)指標(biāo)診斷EMs的ROC曲線

六、多因素Logistic回歸分析影響EMs的危險(xiǎn)因素

將是否發(fā)生EMs作為因變量，以FOXD1 mRNA、miR-216b-5p水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示FOXD1 mRNA高水平、miR-216b-5p低水平是影響EMs發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表6)。

表6 多因素Logistic回歸分析影響EMs發(fā)生的危險(xiǎn)因素

討 論

EMs是臨床上較為常見(jiàn)的良性增殖婦科疾病，其病理機(jī)制是子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡能力減弱，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。EMs雖然是一種良性疾病，但因其具有復(fù)發(fā)、侵襲等特征，可引起惡變?nèi)缪葑兂陕殉舶┑?。EMs具有較高的發(fā)病率，目前我國(guó)約有10%～15%的育齡女性患EMs，且近年來(lái)EMs發(fā)病率逐年呈上升的趨勢(shì)，是導(dǎo)致婦女不孕的最主要因素之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康[14-15]。因此，研究與EMs有關(guān)的標(biāo)志物，對(duì)EMs的早期防治具有重要意義。

FOXD1是FOX家族的一員，研究表明，F(xiàn)OXD1異常表達(dá)與卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[16]。謝力等[17]研究表明，結(jié)腸癌患者癌組織中FOXD1呈高表達(dá)，具有促進(jìn)癌癥發(fā)生的作用，F(xiàn)OXD1的表達(dá)水平與細(xì)胞分化、侵襲、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。但關(guān)于FOXD1在EMs中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，EMs患者在位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達(dá)水平、FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織；EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA表達(dá)水平、FOXD1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于在位子宮內(nèi)膜組織。這些結(jié)果提示FOXD1異常高表達(dá)與EMs的發(fā)生有關(guān)。ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA診斷EMs發(fā)生的AUC為0.730，敏感度為80.5%、特異性為68.6%，提示FOXD1 mRNA對(duì)EMs具有良好的診斷價(jià)值；多因素Logistic回歸分析顯示，F(xiàn)OXD1 mRNA高水平是影響子宮內(nèi)膜異位的危險(xiǎn)因素，提示FOXD1 mRNA可作為EMs診斷的生物標(biāo)志物。

有研究表明，子宮內(nèi)膜中大多數(shù)的基因產(chǎn)物，比如血管生成因子、黏附分子、雌激素的分泌等，受多種miRNAs的調(diào)控，miRNAs在EMs的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用[18-19]。馮婉琴等[20]研究顯示，EMs患者子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達(dá)下調(diào)，參與EMs的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而將miR-34a-5p模擬物轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)后，ESC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力減弱。He等[21]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者癌組織和細(xì)胞中miR-216b呈低表達(dá)，F(xiàn)OXM1呈高表達(dá)，且患者預(yù)后不良，miR-216b通過(guò)靶向調(diào)控FOXM1表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖，其在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，且可反映患者的預(yù)后情況。Pei等[10]研究結(jié)果表明，卵巢癌患者miR-216b-5p表達(dá)下調(diào)，且miR-216b-5p低水平的卵巢癌患者總生存期較短，提示miR-216b-5p異常低表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生及預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，EMs患者在位子宮內(nèi)膜組織中miR-216b-5p表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織，且EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中miR-216b-5p表達(dá)水平顯著低于患者在位子宮內(nèi)膜組織，提示miR-216b-5p異常低表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生有關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果表明，miR-216b-5p診斷EMs的AUC為0.828，敏感度為82.7%、特異性為85.1%，提示miR-216b-5p對(duì)EMs具有良好的診斷價(jià)值；而與FOXD1 mRNA單獨(dú)檢測(cè)相比，二者聯(lián)合檢測(cè)EMs的AUC更高，二者聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)EMs診斷的靈敏度；多因素Logistic回歸分析顯示，miR-216b-5p低水平是影響EMs發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示miR-216b-5p可作為EMs診斷的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者子宮內(nèi)膜組織中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-216b-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控FOXD1的表達(dá)參與EMs的發(fā)生，但具體調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)研究。

綜上所述，F(xiàn)OXD1 mRNA及蛋白、miR-216b-5p在EMs子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)異常，可作為EMs診斷的輔助指標(biāo)。