袁振亞，袁牧，林繼慧，黃曉潔，朱云霞，宋雪梅

(徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，徐州 221009)

反復(fù)種植失敗(RIF)是指在輔助生殖治療周期中，接受多次優(yōu)質(zhì)胚胎移植均無法成功妊娠[1-2]。RIF在IVF-ET周期中的發(fā)生率高達10%～15%，其中約2/3的發(fā)生原因是子宮內(nèi)膜不在容受期[3-6]。子宮內(nèi)膜在特定時期才具有對胚胎的接受能力，稱為種植窗(window of implantation，WOI)，處于WOI的內(nèi)膜對胚胎具有最佳的容受性[7]。WOI出現(xiàn)的時間存在個體差異，按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)推算WOI，可能會有部分患者在子宮形態(tài)學(xué)和組織學(xué)完全正常的情況下，接受優(yōu)質(zhì)胚胎種植后無法成功妊娠。因此，選擇合適的時機進行胚胎移植是治療RIF、提高IVF-ET臨床妊娠率的一種可行方法。

子宮內(nèi)膜容受性檢測(Endometrial receptivity testing，ERT)依托下一代測序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)，對子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因表達量進行分析，構(gòu)建容受前期、容受期和容受后期預(yù)測模型。將受檢者NGS結(jié)果代入模型，可以預(yù)測受檢者當(dāng)前子宮內(nèi)膜是否處于容受期。根據(jù)ERT預(yù)測結(jié)果及時調(diào)整移植策略，在最佳容受期為受檢者植入胚胎，可顯著提高臨床妊娠率[8-12]。多項ERT臨床試驗研究顯示，接受ERT評估后移植的RIF患者凍融胚胎移植(FET)周期(無論是卵裂期胚胎或囊胚期胚胎)的種植率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均顯著高于未行ERT評估的普通FET周期[13-21]。為進一步評估ERT技術(shù)在中國RIF人群中的應(yīng)用效果，我們對接受ERT評估后RIF患者的FET周期結(jié)局進行了回顧分析，探究ERT技術(shù)在本地區(qū)RIF患者IVF-ET周期中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象

本研究選取2019年1月至2021年12月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受FET的RIF患者和非RIF患者。接受ERT評估后移植的RIF患者納入ERT組(n=60)，沒有接受ERT評估的RIF患者納入非ERT組(n=151)，同期非RIF患者納入非RIF組(n=503)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：ERT組和非ERT組患者符合本中心RIF的診斷標(biāo)準(zhǔn)(移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6個或高評分囊胚數(shù)3個及以上均失敗)；FET周期，采用激素替代周期進行內(nèi)膜準(zhǔn)備，移植1～2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚或1枚卵裂期胚胎+1枚囊胚序貫移植；移植胚胎均為優(yōu)質(zhì)胚胎(優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎：7CⅡ及以上，碎片率10%及以下；優(yōu)質(zhì)囊胚：內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層評級均為B及以上)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：FET前子宮內(nèi)膜厚度小于7 mm；FET前患有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；接受胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(pre-implantation genetic testing，PGT)周期的FET。

ERT技術(shù)的臨床應(yīng)用通過了徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用倫理審查(審查意見號：XFYJL-2021-15)。

二、診療回顧

1.ERT評估模型：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院和江蘇億康基因科技有限公司合作開發(fā)了基于轉(zhuǎn)錄組測序的ERT技術(shù)(專利號：201910324707.0)，構(gòu)建了子宮內(nèi)膜容受前期、容受期、容受后期模型。采集受試者的子宮內(nèi)膜樣本，提取mRNA進行高通量測序，獲得受試者的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組信息代入模型進行分析，可以客觀、精準(zhǔn)地判斷受試者的種植窗是否發(fā)生偏移，推算出受試者子宮內(nèi)膜最佳容受期，準(zhǔn)確率達98.4%，對RIF患者胚胎移植具有重要的臨床指導(dǎo)意義[21]。本研究采用該模型，評估ERT在RIF患者FET中的應(yīng)用效果。

2.激素替代方案準(zhǔn)備內(nèi)膜：月經(jīng)第2天，ERT組、非ERT組、非RIF組患者使用長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，麗珠醫(yī)藥集團)，隨后使用雌二醇4～6 mg/d連用14 d(雅培，荷蘭)。非ERT組、非RIF組患者使用黃體酮(默克雪蘭諾，英國)轉(zhuǎn)化5 d(使用第1天定義為P+0)，第6天d(P+5)停用黃體酮，進行FET。ERT組患者第6天(P+5)停用黃體酮，接受內(nèi)膜活檢，根據(jù)ERT結(jié)果調(diào)整使用黃體酮的轉(zhuǎn)化時長再行FET。

3.ERT評估：在ERT組患者黃體酮轉(zhuǎn)化第6天(P+5)使用一次性子宮內(nèi)膜樣本采樣器(蘇州序康醫(yī)療科技)伸入宮腔抽吸約3 mm大小的活檢樣本，推入RNA樣本保存液(蘇州序康醫(yī)療科技)4℃保存；使用RNeasy Micro Kit試劑盒(Qiagen，德國)進行mRNA提取，使用MALBAC白金微量 RNA 擴增試劑盒(蘇州億康基因科技)進行RNA擴增，使用NGS 通用 Index 試劑盒(Illumina，美國)和Miseq基因測序儀(Illumina，美國)進行mRNA測序；將測序結(jié)果代入子宮內(nèi)膜容受期模型，可判斷患者當(dāng)前的內(nèi)膜狀態(tài)(容受前期、容受期或容受后期)，以便調(diào)整移植時間，在容受期進行FET[21]。

4.FET：本研究選擇3種胚胎移植策略：(1)1～2枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎；(2)1枚優(yōu)質(zhì)囊胚；(3)移植1枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎后2～3 d再移植1枚優(yōu)質(zhì)囊胚(序貫移植)。根據(jù)患者IVF周期的實際情況，選擇合適的移植策略進行FET。

三、分析指標(biāo)

各組患者基礎(chǔ)資料，包括女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素水平；FET相關(guān)資料，包括移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、胚胎種植率(孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù))、HCG陽性率(HCG陽性FET周期數(shù)/FET周期數(shù))、生化妊娠率(生化妊娠FET周期數(shù)/FET周期數(shù))、宮內(nèi)妊娠率(宮內(nèi)妊娠FET周期數(shù)/FET周期數(shù))、異位妊娠率(異位妊娠FET周期數(shù)/FET周期數(shù))、流產(chǎn)率(流產(chǎn)FET周期數(shù)/獲宮內(nèi)妊娠FET周期數(shù))、活產(chǎn)率(活產(chǎn)分娩周期數(shù)/FET周期數(shù))；ERT組患者種植窗偏移率(種植窗偏移患者數(shù)/接受ERT評估患者數(shù))。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入了符合標(biāo)準(zhǔn)的患者的714個FET周期。其中，接受ERT評估后移植的RIF患者(ERT組)60周期，未接受ERT評估的RIF患者(非ERT組)151周期，同期非RIF患者(非RIF組)503周期。

各組間女方年齡、不孕年限、BMI、抗苗勒管激素(AMH)水平及基礎(chǔ)激素水平均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料(-±s)

二、ERT評估結(jié)果及相應(yīng)移植時機調(diào)整

ERT組60個周期中有58個周期出現(xiàn)了種植窗的偏移，即在常規(guī)內(nèi)膜準(zhǔn)備情況下，按月經(jīng)周期推算出的移植時期實際為容受前期，偏移率達到了96.67%(58/60)。容受前期屬于子宮內(nèi)膜的非容受期，在這個階段對種植胚胎的容受性較差。根據(jù)ERT檢測結(jié)果，這58個周期的移植時間較常規(guī)移植時間推后1～2 d，而2個種植窗未發(fā)生偏移的周期移植時間不變。

三、FET周期結(jié)局

各組間移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、生化妊娠率、異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組胚胎種植率、HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率均顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。ERT組流產(chǎn)率顯著低于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率低于非RIF組，但無顯著差異(P>0.05)。非ERT組流產(chǎn)率顯著高于非RIF組，而胚胎種植率、活產(chǎn)率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表2)。

表2 患者FET周期結(jié)局[(-±s)，%]

四、不同移植策略的FET周期結(jié)局

1.移植1～2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎：ERT組、非ERT組與非RIF組分別有32周期、74周期、218周期移植1～2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。各組間移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、HCG陽性率、異位妊娠率無顯著差異(P>0.05)。ERT組種植率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率顯著高于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。ERT組流產(chǎn)率顯著低于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組生化妊娠率顯著低于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。非ERT組胚胎種植率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率顯著低于非RIF組，而生化妊娠率、流產(chǎn)率顯著高于非RIF組(P<0.05)(表3)。

2.移植1枚優(yōu)質(zhì)囊胚：ERT組、非ERT組與非RIF組分別有18周期、44周期、161周期移植了1枚優(yōu)質(zhì)囊胚。各組移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、生化妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組種植率、HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率均顯著高于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組活產(chǎn)率顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率低于非RIF組，但無顯著差異(P>0.05)。非ERT組胚胎種植率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表4)。

表3 移植卵裂期胚胎的FET結(jié)局比較[(-±s)，(%)]

表4 移植單個囊胚的FET結(jié)局比較[(-±s)，(%)]

續(xù)表

3.序貫移植1枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚+1枚優(yōu)質(zhì)囊胚：ERT組、非ERT組、非RIF組分別有10周期、33周期、124周期移植了1枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎+1枚優(yōu)質(zhì)囊胚。各組間移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、生化妊娠率、異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率顯著高于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組種植率高于非ERT組，但無顯著差異(P>0.05)，且均顯著低于非RIF組(P<0.05)。ERT組活產(chǎn)率顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(dāng)(P>0.05)。ERT組流產(chǎn)率顯著低于非ERT組(P<0.05)，但均顯著高于非RIF組(P<0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內(nèi)妊娠率低于非RIF組，但均無顯著差異(P>0.05)。非ERT組活產(chǎn)率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表5)。

五、ERT組宮內(nèi)妊娠分析

ERT組有40個FET周期獲得了宮內(nèi)妊娠，其基礎(chǔ)激素水平、女方年齡、移植胚胎數(shù)、BMI、不孕年限、移植日內(nèi)膜厚度、移植1枚囊胚FET周期數(shù)占比、序貫移植FET周期數(shù)占比與20個未獲宮內(nèi)妊娠的FET周期均無顯著差異(P>0.05)；未獲宮內(nèi)妊娠的ERT組患者移植卵裂期胚胎的FET周期數(shù)占比顯著高于獲得宮內(nèi)妊娠的患者(P<0.05)(表6)。

表5 移植卵裂期胚胎+囊胚的FET結(jié)局比較[(-±s)，(%)]

表6 ERT組獲宮內(nèi)妊娠與未獲宮內(nèi)妊娠患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

討 論

RIF是人類輔助生殖領(lǐng)域中亟待解決的重要問題，其發(fā)生原因繁雜且仍未完全被闡明，主要包括胚胎因素、免疫因素及宮腔因素等。多種免疫因子參與了胚胎種植和發(fā)育的過程，在RIF發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但目前對于RIF患者是否應(yīng)使用免疫治療仍存在爭議[22-23]。相比較于卵裂期胚胎，囊胚擁有更好的發(fā)育潛能和移植結(jié)局，可獲得更高的臨床妊娠率[24-25]。臨床上，可采用PGT技術(shù)幫助篩選整倍體胚胎移植，降低因胚胎染色體異常導(dǎo)致種植失敗、胚胎停育或自然流產(chǎn)的發(fā)生率，提高臨床妊娠率[26]。

子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài)對FET結(jié)局具有重要影響[21]。排除宮腔解剖學(xué)異常的因素，如果多次優(yōu)質(zhì)胚胎移植、甚至通過PGT技術(shù)獲得整倍體胚胎移植后仍未獲得成功妊娠，就需要考慮在胚胎移植時子宮內(nèi)膜是否處于最佳容受期[27-28]。臨床上通過改良促排卵方案、移植前宮腔搔刮、宮腔鏡糾正內(nèi)膜形態(tài)、移植前宮腔灌注HCG等可改善子宮內(nèi)膜容受性，提高RIF患者胚胎種植率和臨床妊娠率[29]。本研究結(jié)果證明，接受了ERT評估的RIF患者FET的胚胎種植率、宮內(nèi)妊娠率與活產(chǎn)率均顯著高于未接受ERT的RIF患者，且相當(dāng)于非RIF患者，這與前期ERT研究[21，30]結(jié)果一致。

雖然結(jié)果顯示ERT評估對RIF患者的FET結(jié)局具有顯著改善作用，但本項研究存在局限性。接受ERT評估的RIF患者樣本量較小，仍需更大樣本量驗證ERT評估對RIF患者FET結(jié)局的影響。此外，有一部分RIF患者經(jīng)過ERT評估后仍未成功獲得臨床妊娠的情況值得關(guān)注。ERT是一種根據(jù)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄因子的變化特征判斷胚胎最佳種植時期的技術(shù)，其本質(zhì)上并不能改善患者的子宮內(nèi)膜容受性，對于本身子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)較差的患者作用不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，相比獲得宮內(nèi)妊娠的ERT組RIF患者，未獲宮內(nèi)妊娠的ERT組RIF患者移植卵裂期胚胎的FET周期占比較高(65.00% vs. 47.50%，P<0.05)。比較ERT組三種移植策略的FET結(jié)局，僅移植卵裂期胚胎獲得的宮內(nèi)妊娠率(59.38%)低于移植單個囊胚(72.22%)和序貫移植(80.00%)的宮內(nèi)妊娠率，提示經(jīng)ERT評估的RIF患者采用單個囊胚移植和序貫移植的策略可能獲得更佳的FET結(jié)局，但仍需要更多臨床研究和基礎(chǔ)實驗進一步探討。

RIF在IVF治療中的發(fā)生率可達10%～15%，其復(fù)雜的病因決定了治療方法的多樣化，需要針對不同病患人群選擇合適的治療方案，這正是目前輔助生殖領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。本研究中患者平均年齡較小(≤33歲)，通過ERT評估后移植獲得了較好的FET結(jié)局，但ERT對高齡RIF患者的效果仍需進一步探究。相比低齡人群，高齡RIF患者面臨的主要問題可能是卵巢儲備差、卵巢功能低反應(yīng)、胚胎質(zhì)量差、胚胎非整倍體率高等客觀不利因素，經(jīng)IVF周期獲得的可用胚胎更少。多個移植周期均失敗，給RIF患者帶來了經(jīng)濟和身體上的雙重打擊。在子宮內(nèi)膜最佳容受期完成胚胎移植，對于避免浪費珍貴胚胎、保存患者生育力至關(guān)重要。因此，對于RIF患者，應(yīng)以ERT技術(shù)為保障，精準(zhǔn)定位最佳容受期，同時根據(jù)實際情況可結(jié)合PGT技術(shù)篩選整倍體胚胎，以期獲得最佳FET結(jié)局。ERT技術(shù)可為RIF患者制定移植策略提供指導(dǎo)和依據(jù)，在RIF患者的IVF-ET周期中有廣泛的應(yīng)用前景和重要的臨床應(yīng)用價值。