田曉宇

（中國(guó)計(jì)量大學(xué) 計(jì)量測(cè)試工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

0 引 言

自2019年12月以來(lái)，由新型冠狀病毒引起的新冠肺炎疫情在全球蔓延，目前已導(dǎo)致近4億人感染，近600萬(wàn)人死亡。為遏制疫情擴(kuò)散，許多國(guó)家采取檢測(cè)、隔離措施，但集中檢測(cè)效率低下，且伴有交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。天津等地在疫情發(fā)生后，當(dāng)?shù)仄髽I(yè)提出“核酸測(cè)試（診斷）+家庭自測(cè)（篩查）”（1+1）相結(jié)合的方案阻斷病毒傳播，引起公眾對(duì)自測(cè)試劑盒的關(guān)注。自測(cè)儀器具有快速、便捷等特點(diǎn)，對(duì)病毒速查幫助極大。

目前，新冠病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要依賴核酸檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（RT-PCR）是目前最常用的新冠肺炎感染檢測(cè)手段，雖然該方法的靈敏度和特異性很高，但其檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，且只能在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行檢測(cè)操作，無(wú)法用于快速檢測(cè)。而且現(xiàn)有試劑盒中的試劑和測(cè)試條件沒有得到進(jìn)一步優(yōu)化，這將會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度和特異性，出現(xiàn)“假陽(yáng)性”和“假陰性”結(jié)果。此外，免疫學(xué)檢測(cè)方法中，免疫膠體金層析技術(shù)也是常用手段之一，該方法目前已有試劑盒采用。通過(guò)肉眼觀察的方法，只需一滴血清、血漿或全血即可在10 min內(nèi)完成所有測(cè)試，無(wú)需任何設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，可快速篩查可疑患者。但是此方法靈敏性較低，如果材料等質(zhì)量存在誤差，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，也會(huì)因病人感染時(shí)間較短或者采樣部位不同導(dǎo)致病毒含量較低，出現(xiàn)假陰性。為追求更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，人們逐漸重視熒光免疫層析技術(shù)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，與傳統(tǒng)的膠體金免疫試紙相比，量子點(diǎn)熒光免疫試紙的靈敏度至少提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。

本文設(shè)計(jì)了一種基于Arduino的便攜式熒光分析儀，采用熒光免疫層析法，配合相應(yīng)試劑條，只需一滴血樣即可在10 min鐘內(nèi)完成檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)快速定性、定量檢測(cè)，對(duì)新冠肺炎診斷有很大的指導(dǎo)和幫助，對(duì)輔助檢測(cè)和緩解醫(yī)療壓力有很大作用。

1 整體架構(gòu)

1.1 系統(tǒng)架構(gòu)

本文設(shè)計(jì)的基于Arduino的便攜式熒光分析儀，下位機(jī)使用搭載安信可OV2640高清攝像頭模塊的ESP32-CAM開發(fā)板，作為圖像采集模塊。上位機(jī)由服務(wù)端和客戶端組成。將血樣滴至試劑條，并滴上稀釋液，待10 min后血樣通過(guò)毛細(xì)作用向試劑條上方移動(dòng)，經(jīng)紫外光照射后會(huì)反射熒光，反射圖像由ESP32-CAM獲取，并傳輸至服務(wù)端。服務(wù)端接收?qǐng)D像采集模塊上傳的圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行處理，處理后根據(jù)圖樣繪出量化的光強(qiáng)-坐標(biāo)圖像，與閾值比較后產(chǎn)生定性結(jié)果，最終通過(guò)客戶端手機(jī)APP將定量結(jié)果光強(qiáng)-坐標(biāo)圖像及定性結(jié)果反饋給用戶。系統(tǒng)整體架構(gòu)如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)整體架構(gòu)

1.2 熒光免疫層析技術(shù)

熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以固定檢測(cè)線T（包被有抗體）和質(zhì)控線C（包被有抗體）的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過(guò)毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)。對(duì)于帶有多個(gè)抗原決定簇的大分子抗原（蛋白、病毒、致病菌等），通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法。

在新冠病毒的檢測(cè)過(guò)程中，待測(cè)物在流動(dòng)相作用下先與連接墊處的熒光示蹤物標(biāo)記的新冠病毒抗原結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線T時(shí)再與鼠抗人IgG（IgM）抗體結(jié)合形成雙抗夾心的“三明治”型復(fù)合物，其中熒光標(biāo)記物會(huì)在紫外線照射下反射出熒光。在質(zhì)控線C處，連接墊處的熒光示蹤物標(biāo)記的鼠IgG（IgM）與羊抗鼠IgG（IgM）結(jié)合，熒光標(biāo)記物在紫外線照射下也會(huì)反射出熒光。若質(zhì)控線C處無(wú)熒光，則檢測(cè)失敗；若質(zhì)控線C處有熒光，檢測(cè)線T處無(wú)熒光則結(jié)果為陰性，有熒光則結(jié)果為陽(yáng)性。紫外線照射下試紙如圖2所示。

圖2 紫外線照射下的熒光免疫層析試紙

通過(guò)量化反射熒光的光強(qiáng)可從圖中得出新冠病毒濃度的定量結(jié)果，比較閾值可得出是否感染病毒的定性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 檢測(cè)結(jié)果示意圖

2 硬件設(shè)計(jì)

2.1 紫外線照明模塊

本方案在攝像頭和試劑條卡槽之間的密閉黑暗空間中搭載了紫外線照明模塊，采用紫外線LED，紫外線激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，熒光波長(zhǎng)為612 nm。LED前安置濾光片，截取對(duì)應(yīng)波段波長(zhǎng)的反射光，減少噪聲干擾。該照明模塊的設(shè)計(jì)減少了外界環(huán)境的光線對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生的噪聲，使得檢測(cè)儀器的準(zhǔn)確性和靈敏度得以提高。同時(shí)具有體積小、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，滿足了使用者方便、快捷的使用需求。照明模塊光路圖如圖4所示。

圖4 照明模塊光路示意圖

2.2 ESP32-CAM圖像采集模塊

基于Arduino的ESP32是樂鑫發(fā)布的新一代WiFi芯片，具有性能穩(wěn)定、高度集成、超低功耗等特性，采用體積小的803.11b/g/n WiFi+BT/BLE Soc模塊，其低功耗雙核 CPU 主頻可達(dá)240 MHz，可滿足高清圖像的傳輸需求。ESP32-CAM開發(fā)板搭載了4MPSRAM和200 W像素OV2640高清攝像頭，可實(shí)現(xiàn)高清圖像的采集。

圖像采集及上傳過(guò)程中，首先，OV2640攝像模塊將采集的圖像存儲(chǔ)在PSRAM中，然后通過(guò)wifi.begin（）函數(shù)啟動(dòng)ESP32的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)，初始化相機(jī)后再通過(guò)esp_camera_fb_get（）函數(shù)拍攝圖片，經(jīng)http.begin（）函數(shù)請(qǐng)求url、通過(guò)http.addHeader（）函數(shù)請(qǐng)求頭部信息，最后完成圖像上傳。程序串口調(diào)試如圖5所示。

圖5 程序串口調(diào)試界面

用于接收的服務(wù)端采用巴法云服務(wù)器。巴法云物聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)支持多模式數(shù)據(jù)交互，協(xié)議規(guī)范，兼容性強(qiáng)，能保證低功耗下數(shù)據(jù)的完整性。同時(shí)支持發(fā)布/訂閱模式，方便通信設(shè)備間的耦合，且支持微信小程序，為后續(xù)手機(jī)APP的開發(fā)帶來(lái)便利。圖片上傳調(diào)試如圖6所示。

圖6 圖片上傳調(diào)試界面

3 軟件設(shè)計(jì)

3.1 圖像處理程序

由于拍攝時(shí)光照具有不確定性，攝像頭的采集環(huán)境難以達(dá)到理想狀態(tài)，將對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成巨大影響。因此，我們對(duì)攝像頭采集的圖像進(jìn)行處理：首先，將原圖像進(jìn)行灰度圖轉(zhuǎn)換；其次，通過(guò)對(duì)二值化圖進(jìn)行開運(yùn)算以消除灰度圖中的噪聲點(diǎn)，再對(duì)待測(cè)區(qū)域進(jìn)行提??；最后，把待測(cè)區(qū)域中對(duì)應(yīng)位置的光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為數(shù)值，通過(guò)比較質(zhì)控線C處參考峰與檢測(cè)線T處的峰值確定已知樣本的檢測(cè)情況，具體步驟如下：

（1）首先將采集的圖像進(jìn)行灰度化和二值化處理。采用加權(quán)平均值法將彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，使得彩色的，，分量值相等，且灰度化處理時(shí)灰度值的范圍為[0，255]。先將圖像進(jìn)行歸一化處理，通過(guò)對(duì)，，統(tǒng)一歸一化以去除光照和陰影的影響，其歸一化模型可以表示為：

灰度處理后，由于所收到的熒光光強(qiáng)不均勻，因此還需要對(duì)圖像進(jìn)行二值化分割。傳統(tǒng)的OSTU法只能在一定程度上移除光照信息，效果不佳，這里我們引入基于OTSU法的分塊閾值法。

該算法中，圖像被分割成若干塊，考察這些分塊中像素灰度的變化情況，計(jì)算所有像素的平均絕對(duì)偏差，一塊圖像區(qū)域的平均絕對(duì)偏差代表該區(qū)域內(nèi)的灰度變化是劇烈或平坦。分塊示意圖如圖7所示。

圖7 分塊示意圖

為判斷灰度變化是否平坦，取當(dāng)前區(qū)域周邊比該區(qū)域大的部分，比較該區(qū)域和周圍區(qū)域的像素灰度變化，判斷當(dāng)前區(qū)域的灰度變化是否平坦。算法如下：

局部窗口在整張圖像中移動(dòng)時(shí)，每個(gè)子塊對(duì)應(yīng)的絕對(duì)偏差通過(guò)加權(quán)后得到閾值，公式為：

式中：為子塊落入局部窗口的個(gè)數(shù)；為子塊標(biāo)號(hào)；為第個(gè)子塊的平均絕對(duì)偏差；k為落入窗口中的比例因子。

式中：sum為第個(gè)子塊落入滑動(dòng)窗口的像素?cái)?shù)；sum為像素總數(shù)。

比較滑動(dòng)窗口的平均絕對(duì)偏差，比較和來(lái)判斷灰度的變化情況：

式中，為經(jīng)過(guò)大量樣本得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，取0.5最佳。

對(duì)平坦變化區(qū)域的處理：

將圖像分割成若干塊，用OTSU算法計(jì)算每個(gè)小塊的二值化閾值，再統(tǒng)計(jì)不同子塊落入局部窗口中面積的比例，得到比例因子，最終通過(guò)加權(quán)得到閾值：

式中，為第個(gè)子塊對(duì)應(yīng)的OTSU閾值。當(dāng)窗口內(nèi)灰度變化平坦時(shí)，比較中心像素灰度值和計(jì)算的閾值，并進(jìn)行二值化操作：

對(duì)劇烈變化區(qū)域的處理：

在灰度變化劇烈的情況下，圖像中可能包含一定數(shù)量的灰度值和局部窗口閾值非常接近的像素。因此我們分別討論灰度值遠(yuǎn)離閾值和接近閾值的情況。

當(dāng)局部中心窗口像素灰度遠(yuǎn)離閾值“”時(shí)：

式中，為中心窗口灰度值和閾值的距離，本文中取0.5。

當(dāng)局部中心窗口像素接近閾值“”時(shí)：

式中，Mean和為局部窗口像素灰度平均值和平均絕對(duì)偏差。

通過(guò)OSTU單閾值法和分塊閾值法得到不同的二值圖，如圖8所示。

圖8 2種算法得到的二值圖

（2）對(duì)二值圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)處理?；叶然投祷幚砗蟮膱D像仍帶有大量噪聲點(diǎn)，為濾除噪聲，本文采用開運(yùn)算去除二值圖中的細(xì)小顆粒，實(shí)現(xiàn)圖像骨干信息的提取。開運(yùn)算是對(duì)同一圖片先腐蝕后膨脹的操作。

Step1.腐蝕

針對(duì)二值化圖像中值為非“0”的像素進(jìn)行操作，以像素為中心，附近九宮格內(nèi)若含值為“0”的像素，則將像素置“0”。腐蝕在數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)運(yùn)算中的作用是消除物體的邊界點(diǎn)。在數(shù)字圖像處理中，對(duì)于確定的結(jié)構(gòu)元素，通過(guò)腐蝕運(yùn)算可以消除小于結(jié)構(gòu)元素的噪聲點(diǎn)、消除物體邊界點(diǎn)、去除小于結(jié)構(gòu)元素的物體、清除兩個(gè)物體間的細(xì)小連通等。設(shè)為圖像集合，為結(jié)構(gòu)元素，腐蝕用集合的方式可表示為：

Step2.膨脹

針對(duì)二值化圖像中值為“0”的像素進(jìn)行操作，以像素為中心，附近九宮格內(nèi)若含值為非“0”的像素，則將像素置“1”（或255）。對(duì)于灰度圖像，將取“1”的位置賦值以特定結(jié)構(gòu)重合部位的灰度值的最大值。通過(guò)膨脹，可以將與物體接觸的所有背景點(diǎn)合并到物體中，使目標(biāo)增大，添補(bǔ)目標(biāo)中的空洞。用集合語(yǔ)言定義膨脹運(yùn)算的定義形式為：

開運(yùn)算后的二值圖如圖9所示。

圖9 開運(yùn)算后的二值圖

（3）對(duì)于攝像頭采集的圖像，需要對(duì)質(zhì)控線C、檢測(cè)線T進(jìn)行定位，以在曲線圖繪制過(guò)程中確定各檢測(cè)線對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)值。首先通過(guò)找到C線前的矩形和T線后的矩形，確定二者重心，二者之間的長(zhǎng)度為待識(shí)別的長(zhǎng)度，通過(guò)二重心來(lái)確定待測(cè)區(qū)域。區(qū)域選擇如圖10所示。

圖10 區(qū)域選擇示意圖

（4）將灰度處理和形態(tài)學(xué)處理后的圖像灰度值進(jìn)行平均值處理。對(duì)圖像軸方向灰度值數(shù)據(jù)求取平均值，可以得到圖像軸方向的光強(qiáng)變化，并做出以圖像軸方向?yàn)闄M坐標(biāo)，試劑條上光強(qiáng)為縱坐標(biāo)的光強(qiáng)-坐標(biāo)曲線圖。最終檢測(cè)所用圖像如圖11所示，做出的光強(qiáng)-坐標(biāo)圖像如圖12所示。

圖11 最終用于檢測(cè)的灰度圖

圖12 經(jīng)過(guò)分析后的光強(qiáng)-坐標(biāo)圖

（5）對(duì)曲線圖進(jìn)行處理比較，得到最終結(jié)果。對(duì)試紙條上兩種檢測(cè)線對(duì)應(yīng)位置處的光強(qiáng)大小進(jìn)行量化，通過(guò)光強(qiáng)和坐標(biāo)軸的對(duì)應(yīng)圖可以得到代表試劑條上質(zhì)控線C、檢測(cè)線T的峰，其中質(zhì)控線對(duì)應(yīng)的峰為參考峰。比較曲線圖中檢測(cè)線T與質(zhì)控線C處圖像峰值。對(duì)于做出的圖像，設(shè)定有峰閾值，并求出每個(gè)峰的峰值。對(duì)于峰值大于設(shè)定閾值的峰認(rèn)為是有效峰。最終有效峰的個(gè)數(shù)為1，且僅存在參考峰時(shí)，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陰性；峰個(gè)數(shù)為2時(shí)，代表檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。同時(shí)根據(jù)光強(qiáng)量化值可得出對(duì)應(yīng)新冠病毒濃度的定量檢測(cè)結(jié)果。整體的圖像處理流程如圖13所示。

圖13 圖像處理流程

3.2 手機(jī)APP程序

利用巴法云發(fā)布/訂閱模式設(shè)置主題，通過(guò)ESP32-CAM模塊向設(shè)置好的主題發(fā)送消息，已訂閱該主題的微信小程序接收信息，顯示檢測(cè)得到的定量光強(qiáng)-坐標(biāo)圖像和定性檢測(cè)結(jié)果。微信小程序界面如圖14所示。

圖14 微信小程序界面

4 結(jié) 語(yǔ)

本文針對(duì)新冠肺炎病毒檢測(cè)精度低、檢測(cè)繁瑣、效率低下、便捷儀器匱乏等諸多問(wèn)題，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了基于Arduino的便攜式熒光分析儀，實(shí)現(xiàn)了新冠肺炎病毒的快速、便捷檢測(cè)。同時(shí)，本文設(shè)計(jì)的便攜式熒光分析儀理論上可完成對(duì)于相同檢測(cè)原理的病毒、病菌、蛋白等的檢測(cè)，隨著熒光免疫層析技術(shù)逐漸得到應(yīng)用，相關(guān)儀器日漸完善，應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力巨大。