薛寶玲，宋曉彬

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109；2.烏蘭察布市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

肌球蛋白是參與肌肉伸縮活動的一種形似“Y”形且具有ATP酶活性的大基團(tuán)生物活性物質(zhì)，由2 條肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）和4 條輕鏈組成。2 條重鏈分子質(zhì)量約為210 kDa，大部分空間區(qū)域相互纏繞螺旋形成桿狀的尾部，4 條輕鏈分子質(zhì)量為18～32 kDa，構(gòu)成“Y”形的頭部。肌肉伸縮依靠MyHC參與，MyHC的功能多樣性與肌動蛋白的特異性與受到Ca作用時(shí)ATP酶活性的功能多樣性相關(guān)。紅肌纖維與白肌纖維都有對應(yīng)的基因進(jìn)行翻譯編碼，Chang等研究表明，MyHC相關(guān)基因的特異性表達(dá)是骨骼肌肌纖維進(jìn)行相應(yīng)分型的依據(jù)。

不同的MyHC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)都有相對應(yīng)的基因進(jìn)行編碼，研究證實(shí)，骨骼肌肌纖維依據(jù)MyHC相關(guān)基因的特異性表達(dá)分為Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型。本研究采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）法分離1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌中MyHC異構(gòu)體，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)測定MyHC相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量并分析其與肌球蛋白含量之間的相關(guān)性，旨在為提高肉品質(zhì)和農(nóng)畜產(chǎn)品的深度加工所需參數(shù)提供有效數(shù)據(jù)支撐，為自然放牧條件下小尾寒羊的最佳育肥月齡提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自然放牧條件下的1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌作為研究對象（=3）。將股二頭肌迅速分裝，保存于無酶無菌EP管中避免肌纖維受到破壞，液氮快速冷凍， -80 ℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)測定使用。

核酸染料 北京擎科生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（北京）有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基乙二胺 上海浦予工業(yè)科技有限公司；SDS 河南派廣化工有限公司；-巰基乙醇 上海至吉生化科技有限公司；過硫酸銨 邯鄲市叢臺區(qū)少杰化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 合肥健砷化工有限公司；丙烯酰胺 天津西典化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31光學(xué)顯微鏡 上海惠誠生物科技有限公司；MS-H-S磁力攪拌器 信鈺儀器（北京）有限公司；FSH-2A勻漿機(jī) 濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；TD5A臺式離心機(jī) 常州金壇良友儀器有限公司；DYY-6C穩(wěn)流恒壓電泳儀 濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司； LB-E05050電子天平 蘇州卡吉德化學(xué)科技有限公司；LHS-80HC-1恒溫恒濕箱 濟(jì)南思明特科技有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 武漢鑫九星電子科技有限公司；ZT-288凝膠成像儀 上海金鵬分析儀器有限公司；CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad 公司；WSB-18恒溫水浴振蕩器 北京漢達(dá)森機(jī)械技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Light等方法進(jìn)行提取。取1.5～2.0 cm肌肉組織，去掉結(jié)締與脂肪組織并切碎。稱取15 mg切碎的肌肉組織，加入750 μL蛋白準(zhǔn)備液（pH 6.8、0.05 mol/L KPO），3 000 V、0.3 s勻漿5 次，4 ℃靜置50 min，3 000 r/min離心15 min后取上層液體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肌球蛋白含量的測定

采用BCA法測定肌球蛋白含量。準(zhǔn)確稱取所需用量的BSA，保存?zhèn)溆谩７謩e稱取10 g BCA二鈉鹽、20 g無水NaCO、1.6 g NaCHO、4 g NaOH與9.5 g NaHCO混合，定容至1 L。液體混合均勻后pH值調(diào)至11即為BCA法A溶液；4 g CuSO定容至100 mL即為BCA法B溶液。BCA法A溶液與B溶液按照體積比49∶1充分混勻后配制成BCA法工作液C。標(biāo)準(zhǔn)品（400 μg/mL BSA溶液）與工作液C等體積混勻，置于35 ℃恒溫恒濕保存50 min。

根據(jù)表1的比例進(jìn)行配制，以BSA含量作為橫坐標(biāo)（），測得的作為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為=0.025 6+0.137 7（=0.990 3），表明與BSA含量的相關(guān)性良好。根據(jù)所測標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品的肌球蛋白含量。

表1 肌球蛋白含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 1 Preparation of standard curve for quantitative analysis of myosin

1.3.3 SDS-PAGE分離MyHC異構(gòu)體

參考Light等的方法。配制樣品緩沖液、下槽緩沖液、上槽緩沖液、分離膠與濃縮膠；2×樣品緩沖液與提取得到的上清液按照體積比1∶2混合均勻配制為樣品溶液，振蕩45 s，煮沸5 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，樣液終質(zhì)量濃度10～110 ng/μL；下槽緩沖液注入下槽，上槽緩沖液注入上槽，4 ℃條件下用微量進(jìn)樣器在膠孔中按順序注入25 μL樣液；接通電源，調(diào)節(jié)層析柜溫度始終保持4 ℃，電泳儀140 V電壓進(jìn)行SDS-PAGE，至藍(lán)色移動條距離凝膠板底部2 cm位置時(shí)停止電泳；染色時(shí)間為1.5 h，脫色液定時(shí)更換至染色凝膠清晰，取下凝膠板。

1.3.4 骨骼肌總RNA的提取

參考TRIzol法，快速研磨肌肉組織，隨時(shí)補(bǔ)充液氮使其始終處于冷凍狀態(tài)，取300～500 mg備用，將100～150 mg樣品組織放入1.5 mL滅酶滅菌EP管中低溫放置12 min；4 ℃、3 000 r/min離心8 min取上清液，加入約為其體積20%的氯仿，強(qiáng)烈混勻20 s，20 ℃靜置至無分相沉淀產(chǎn)生；4 ℃、3 000 r/min離心20 min，保留上清液，加入與其等體積的異丙醇于滅酶滅菌管中，20 ℃保存20 min；4 ℃、3 000 r/min離心15 min棄上清液，下層沉淀即為白色膠狀RNA，加入1 mL滅酶滅菌水配制的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，上下顛倒洗滌沉淀；4 ℃、3 000 r/min離心8 min棄上清液；反置于20 ℃下干燥；加入30～60 μL滅酶滅菌水溶解凝膠沉淀至完全溶解， -80 ℃放置；取10 μL RNA溶液與4 μL試劑盒緩沖液混勻，測定總RNA質(zhì)量，對其含量進(jìn)行判定；根據(jù)樣品RNA的OD/OD值，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為500 ng/μL。

1.3.5 反轉(zhuǎn)錄與引物合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c D N A第1鏈；按照、、和4 種基因的核苷酸序列，應(yīng)用Primer Premier軟件進(jìn)行分析，由博覽特生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和合成。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，看家基因?yàn)閮?nèi)參，每個(gè)樣品進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總體系為50 μL，其中：滅菌ddHO 17 μL、cDNA模板4 μL、上游引物 （1 μmol/L）2 μL、下游引物（1 μmol/L）2 μL、SYBR Premix ExII（2×）25 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析采用PROC ANOVA程序，多重比較采用Duncan程序，相關(guān)性分析采用Proc Corr程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 股二頭肌中肌球蛋白含量測定結(jié)果

由表2可知，1～9 月齡小尾寒羊股二頭肌中肌球蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，且1～6 月齡間差異顯著 （＜0.05），6～12 月齡肌球蛋白含量差異不顯著，在9 月齡達(dá)到峰值，肌球蛋白含量與吸光度總體呈現(xiàn)線性規(guī)律。

表2 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌的肌球蛋白含量Table 2 Content of myosin in the Biceps femoris muscle of Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.2 SDS-PAGE分離MyHC

Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC主要是由其所在的基因所決定的。Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC分子質(zhì)量有所差異，通過SDS-PAGE將Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型的MyHC進(jìn)行分離。通常情況下，不同類型基因的特異性表達(dá)與不同類型的肌纖維之間存在相互對應(yīng)關(guān)系，不同基因之間也存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，這也是導(dǎo)致Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型MyHC之間相互轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素。由圖1可知，分離出MyHC中的4 種類型，這一結(jié)果與本團(tuán)隊(duì)前期ATPase組織化學(xué)染色結(jié)果相一致，表明小尾寒羊股二頭肌中存在上述類型的MyHC。Ⅱa、Ⅱb型的MyHC條帶較Ⅱx型的MyHC略為清晰，是由于Ⅱx型MyHC屬于中間型MyHC，易于轉(zhuǎn)化。

圖1 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌肌球蛋白異構(gòu)體SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of myosin heavy isoforms in Biceps femoris muscle of Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.3 骨骼肌中總RNA含量和純度及質(zhì)量檢測

由表3可知，3～12 月齡小尾寒羊股二頭肌OD/OD差異不顯著，1～3 月齡與12～18 月齡之間差異顯著 （＜0.05），并且呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在3 月齡達(dá)到最大。1～18 月齡樣品的OD/OD為1.8～2.0，表明總RNA在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可被繼續(xù)使用。

表3 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌OD260 nm/OD280 nm及總RNA含量Table 3 OD260 nm/OD260 nm and total RNA content in Biceps femoris muscle in Small Tailed Han sheep aged from 1 to 18 months

2.4 MyHC相關(guān)基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

由圖2可知，普通實(shí)時(shí)熒光定量P C R擴(kuò)增出的基因長度為200 bp、基因長度為284 bp、型基因長度為216 bp、型基因長度為165 bp，看家（內(nèi)參）基因長度為233 bp。與Marker進(jìn)行比對得出，Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型基因長度與預(yù)計(jì)相一致，并且沒有其他條帶，說明Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb與Ⅰ型基因片段出現(xiàn)明顯的特異性擴(kuò)增條帶，基因引物的特異性良好，滿足后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)精度要求。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of real-time PCR amplified products

2.5 股二頭肌實(shí)時(shí)熒光定量PCR

圖4 MyHC基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR溶解峰Fig. 4 Real-time PCR melting peaks of MyHC gene

由圖3～4可知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線達(dá)到所設(shè)閾值范圍，溶解曲線說明、、、和基因序列都是單一峰值，各引物特異性良好，沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增并且沒有產(chǎn)生引物二聚體。表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得的相對表達(dá)量分析數(shù)據(jù)可信。

圖3 MyHC基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig. 3 Real-time PCR amplification curve of MyHC gene

由表4可知，小尾寒羊股二頭肌基因總體呈現(xiàn)隨著月齡的遞增相對表達(dá)量穩(wěn)步遞減的趨勢，1～18 月齡中兩端月齡分別為最高值與最低值?；蚩傮w呈現(xiàn)隨著月齡的遞增相對表達(dá)量先降低后增加的趨勢，差異均顯著（＜0.05），12 月齡為最高值，6 月齡為最低值?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量與基因總體呈現(xiàn)出相反的趨勢，隨著月齡的增加逐漸增加，1～18 月齡中兩端月齡分別為最低值與最高值?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量總體上差異均顯著，12 月齡為最高值，9 月齡為最低值。基因相對表達(dá)量測定結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果一致?？傮w上看，隨著月齡的增加，小尾寒羊股二頭肌中、基因的相對表達(dá)量高于基因。

表4 1～18 月齡小尾寒羊股二頭肌MyHC基因相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of MyHC gene in Biceps femoris muscle during one to 18 months of age

3 結(jié) 論

隨著1～18 月齡的變化，小尾寒羊股二頭肌中基因的相對表達(dá)量與同月齡時(shí)肌球蛋白含量變化規(guī)律一致。小尾寒羊股二頭肌中基因相對表達(dá)量高于基因，基因相對表達(dá)量低于基因和基因相對表達(dá)量之和，與前期研究肌纖維含量變化相一致?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量在6～9 月齡變化范圍較大，9～12 月齡變化范圍較小，6～9 月齡生長緩慢，9～12 月齡生長較快。肌球蛋白含量可能是由于1～18 月齡小尾寒羊在天然放牧條件下由于受自然條件的變化發(fā)生變化。小尾寒羊自身發(fā)育時(shí)，可能由于品種、部位、外界飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)因素區(qū)別等，導(dǎo)致骨骼肌中不同肌纖維類型之間能夠相互轉(zhuǎn)化。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定MyHC相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量可以確定股二頭肌中不同類型肌纖維，本實(shí)驗(yàn)所用到的分析方法是建立在分子水平上，因此用到的實(shí)驗(yàn)樣品較少卻能反映出樣品的整體情況，在遺傳育種、飼養(yǎng)等實(shí)踐中有廣泛的應(yīng)用和潛在的價(jià)值。