劉雪婷，孫小慧，朱建敏*，李林，李文悅

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) a.中醫(yī)學(xué)院;b.第一臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250013；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計，2020年女性乳腺癌已超過肺癌成為最常見的癌癥，新增病例約230萬例，占所有癌癥的11.7%[1]。目前治療方式以手術(shù)為主，根據(jù)分期和激素受體狀態(tài)，可能包括化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療[2]，這些治療在顯著提高生存率的同時也會產(chǎn)生長期的生理和心理后遺癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。隨著中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療成為乳腺癌綜合治療的重要部分，具有扶正抗癌、調(diào)節(jié)體質(zhì)、緩解因化療引起的不良反應(yīng)、提高患者生活質(zhì)量等作用。

乳腺癌屬于中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué) “乳巖”“石癰”“奶巖”的范疇，氣滯血瘀貫穿乳巖發(fā)生發(fā)展的始末，氣為血之帥，血隨氣行，若肝氣不舒，則血行不暢，日久形成癥瘕積聚，治法當(dāng)行氣活血化瘀[3]。中醫(yī)認(rèn)為乳巖發(fā)生發(fā)展的重要病機(jī)之一為瘀血內(nèi)阻[4]，三棱-莪術(shù)是臨床上常用的活血化瘀藥對,三棱更善長破血，莪術(shù)行氣之力更強(qiáng)。現(xiàn)代研究表明，二者的共同抗癌機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞周期、抗血管內(nèi)皮生成、調(diào)控腫瘤微環(huán)境[5]。

莪術(shù)味辛、苦，性溫，歸肝、脾二經(jīng)，首載于《藥性論》，有破氣行血、消積止痛之功，三棱性味及所治病證與莪術(shù)相似，始載于《本草拾遺》?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明，莪術(shù)的活性成分主要有姜黃素類、揮發(fā)油、莪術(shù)醇、多糖類[6]，姜黃素類發(fā)揮活血化瘀作用[7]，莪術(shù)油是莪術(shù)發(fā)揮抗腫瘤功效的主要成分，可用于乳腺癌的防治[8]。三棱總黃酮亦可抗腫瘤、抗栓。盡管三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌療效在臨床中得到證實，但其具體的作用機(jī)制仍未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物學(xué)、藥理學(xué)與傳統(tǒng)中藥相結(jié)合，構(gòu)建有效活性成分-疾病-靶點-通路途徑網(wǎng)絡(luò)，與中醫(yī)學(xué)整體觀與辨證論治不謀而合[9]。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌的有效活性成分及作用機(jī)制，為今后開展其臨床研究與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 藥物有效成分及作用靶點收集

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)獲取三棱、莪術(shù)的活性成分，以口服生物利用度(oralbio-availability， OB)≥30%和類藥性(drug-likeness ，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，最終確定三棱、莪術(shù)有效活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢其有效活性成分相對應(yīng)的靶蛋白，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，物種選擇為Homo sapiens，剔除非人類、重復(fù)及不規(guī)范的靶點，將靶基因進(jìn)行基因符號Gene Symbol標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 疾病相關(guān)靶點篩選

將“breast cancer”分別輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)進(jìn)行檢索，將兩個數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果合并刪除重復(fù)項后獲得乳腺癌相關(guān)靶點，運(yùn)用維恩圖將藥物靶點和乳腺癌的治療靶點取交集，獲得三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌的靶點。

1.3 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以藥物、有效活性成分、疾病、交集靶點為節(jié)點，通過Excel表格構(gòu)建相應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中繪制中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件中的Network Analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，計算?jié)點的度值(degree)、介度中心性(betweenness centrality, BC)和緊密中心性(closeness centrality，CC),設(shè)置閾值為BC值中位數(shù)和CC值中位數(shù)，按度值大小排序篩選關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)，將所得數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)出到Excel表格中再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein intrraction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，使用Cytoscape中MCODE插件進(jìn)行分析篩選出前10個蛋白，作為三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的核心靶點。

1.5 GO功能富集與KEGG通路分析

將交集靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。設(shè)置閾值P<0.01，排除非特異性GO功能及KEGG通路，依據(jù)P值大小篩選出與乳腺癌關(guān)聯(lián)度較大的條目，繪制氣泡圖。Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，綜合預(yù)測三棱-莪術(shù)與乳腺癌的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。

1.6 分子對接驗證

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3的關(guān)鍵靶點，與三棱-莪術(shù)藥對有效活性成分進(jìn)行分子對接。從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載小分子配體的2D結(jié)構(gòu)，使用chem3D軟件完成優(yōu)化力學(xué)結(jié)構(gòu)，在AutoDockTools中操作，檢測配體的root、選擇配體可旋轉(zhuǎn)的鍵，并導(dǎo)出pdbqt格式文件。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取靶點的最佳三維晶體結(jié)構(gòu)文件，保存為pdb格式。經(jīng)Pymol軟件進(jìn)行去水、加氫后，利用AutoDock軟件計算電荷、添加原子類型，轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，利用AutoDock Vina軟件計算靶點與活性成分之間的最低結(jié)合能并將分子對接驗證結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 三棱-莪術(shù)有效成分及作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選參數(shù)，初步得到8個活性成分。莪術(shù)有3個，三棱有5個，其中常春藤皂苷元(MOL000296)為二者共有成分，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后剩余活性成分7個。結(jié)合Unitprot數(shù)據(jù)庫確認(rèn)并轉(zhuǎn)換，最終共得到73個藥效靶點。

2.2 乳腺癌靶點篩選

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索合并去重后得到3 629個乳腺癌相關(guān)靶點。運(yùn)用venny平臺將三棱-莪術(shù)藥效靶點與乳腺癌的治療靶點取交集，得到三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌的靶點43個，如圖1所示。

圖1 藥物靶點和疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of the drug targets and disease targets

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建三棱-莪術(shù)的藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。該網(wǎng)絡(luò)共含有53個節(jié)點和118條邊，涉及7種活性成分和43個潛在靶點，以不同的顏色或形狀來表示。按度值排序，得到芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇這3個成分可能是三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的關(guān)鍵成分，從圖中可以看出同一成分對應(yīng)多個靶點和多個成分對應(yīng)同一靶點的關(guān)系，體現(xiàn)了三棱-莪術(shù)多成分、多靶點抗乳腺癌的作用特點。

注：黃色菱形節(jié)點代表疾?。凰{(lán)色橢圓形節(jié)點代表藥物；粉色矩形節(jié)點代表成分；綠色橢圓形節(jié)點代表靶點。圖2 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The drug-ingredient-disease-target network map

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點的篩選

利用Cytoscape 3.7.2繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及41個節(jié)點，195條邊，如圖3所示。

注：圖中節(jié)點表示蛋白，度值用節(jié)點大小與顏色表示，邊表示功能相關(guān)性，邊的粗細(xì)反映作用強(qiáng)度(combine score)。圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of PPI

使用Cytoscape中MCODE插件進(jìn)行分析，篩選出排名前10的關(guān)鍵蛋白，分別是JUN、CASP3、PTGS2、ESR1、MPK14、PPARG、SIRT1、NOS3、TGFB1、NOS2，如圖4所示，這10個蛋白在整個網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，由此可見，JUN、CASP3、PTGS2為三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的核心靶點。

注：顏色由淺黃到深紅，顏色越深，表示蛋白的作用越強(qiáng)。圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點Fig.4 The key nodes of the PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果

通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對43個潛在靶點進(jìn)行GO和KEGG分析，共獲得303條GO條目，包括214個生物過程、63個分子功能、26個細(xì)胞組分。如表1所示，生物過程主要是對雌二醇的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄DNA模板正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子起始轉(zhuǎn)錄、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；表2所示，分子功能主要是類固醇激素受體、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、類固醇結(jié)合等；表3所示，細(xì)胞組分主要是膜筏、細(xì)胞質(zhì)、核、核質(zhì)、核染色質(zhì)、線粒體、線粒體外膜等。KEGG富集通路如圖5所示，主要是VEGF信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、催乳素信號通路、P13K-Akt信號通路、AMPK信號通路等。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見OSID附圖1。

表1 三棱-莪術(shù)治療乳腺癌涉及的主要生物過程(前10位)

表2 三棱-莪術(shù)治療乳腺癌涉及的主要分子功能(前10位)

表3 三棱-莪術(shù)治療乳腺癌涉及的主要細(xì)胞組分(前10位)

表3(續(xù))

注: P值大小與顏色有關(guān)，顏色越紅，代表P值越小，可信度越高；富集條目數(shù)量與節(jié)點大小有關(guān)，節(jié)點越大，代表富集條目數(shù)量越多。圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接結(jié)果

PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3的關(guān)鍵靶點JUN、CASP3、PTGS2與三棱-莪術(shù)藥對有效活性成分常春藤皂苷元、β-谷甾醇、芒柄花黃素、豆甾醇、反式軟骨酸進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果如表4所示。

表4 有效活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果

表4(續(xù))

分子對接的分值用于評估藥物活性成分與核心靶點之間的結(jié)合活性，結(jié)合能<-4.25 kJ/mol表示小分子配體與蛋白受體之間有結(jié)合活性；結(jié)合能<-5.0 kJ/mol表明兩者之間有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能<-7.0 kJ/mol則說明二者之間有很強(qiáng)烈的結(jié)合能力[10]。根據(jù)分子對接結(jié)合能最低值篩選出結(jié)合能力最優(yōu)的前四組蛋白，即PTGS2與常春藤皂苷元、β-谷甾醇、芒柄花黃素、豆甾醇結(jié)合性最好，如圖6所示，常春藤皂苷元通過HIS-356、LYS-97、ASN-581、SER-579氨基酸殘基形成四條氫鍵，β-谷甾醇通過LYS-532、GLN-372氨基酸殘基形成兩條氫鍵，芒柄花黃素通過GLN-461、ASN-39氨基酸殘基形成兩條氫鍵，豆甾醇通過ARG-333形成一條氫鍵，均與PTGS2緊密結(jié)合。

圖6 有效活性成分與核心靶點蛋白的分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of the effective active ingredients and core target proteins

3 討論

藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示，三棱-莪術(shù)藥對的核心活性成分包括常春藤皂苷元、芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇、反式軟骨酸。常春藤皂苷元(MOL000296)為二者共同成分，通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，降低線粒體APAF-1和細(xì)胞色素C蛋白，上調(diào)caspase-3和caspase-9的活性[11]。β-谷甾醇可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制PI3K-Akt信號通路，可用于治療乳腺癌、前列腺癌和冠狀動脈疾病[12]。豆甾醇與化療藥物協(xié)同抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，有廣泛的抗癌作用[13]。芒柄花黃素通過抑制纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)的活性抑制腫瘤血管內(nèi)皮生成，抑制乳腺癌細(xì)胞中CXCR4和HIF-1α的過度表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并阻斷致癌信號通路[14]。賈紹華等[15]研究表明，芒柄花素通過激活JNK信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖可見JUN、CASP3、PTGS2、ESR1、MPK14等是三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的關(guān)鍵靶點。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)是一種復(fù)雜的信號通路，對于將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為廣泛的細(xì)胞過程至關(guān)重要。c-Jun N-末端激酶(JNK)通路是參與細(xì)胞活動調(diào)節(jié)的三種具有良好特征的MAPK通路之一，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化生長[16]。Caspase家族是腫瘤細(xì)胞凋亡的起始者和執(zhí)行者，首先Caspase起始因子被凋亡信號激活，接著下游的Caspase效應(yīng)因子激活， Caspase-3被激活后通過破壞細(xì)胞的蛋白結(jié)構(gòu)和功能水解細(xì)胞一系列底物，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，成為腫瘤治療的主要靶點[17]。PTGS2是血管生成環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，通過提高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)來刺激腫瘤血管生成。近年來，PTGS2與癌癥之間的潛在關(guān)系已成為抗癌研究的熱點，并且已經(jīng)證明PTGS2可能在腫瘤促進(jìn)，特別是乳腺癌中發(fā)揮重要作用。PTGS2的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲性、轉(zhuǎn)移，以及抑制凋亡和免疫監(jiān)測[18]。雌激素受體-1(ESR1)基因編碼雌激素受體-α(ERα)，在70%的乳腺癌中表達(dá)，ERα表達(dá)可通過影響雌激素代謝途徑調(diào)節(jié)乳腺癌風(fēng)險，ESR1突變是ER陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療抵抗和轉(zhuǎn)移的原因，并對芳香化酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性[19-21]。MAPK14編碼p38 MAPK的α亞單位，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，MAPK14通過與TGF-β13的協(xié)同作用在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中起著至關(guān)重要的作用[22]。

GO富集分析結(jié)果顯示，三棱-莪術(shù)抗乳腺癌的關(guān)鍵靶點主要通過影響類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、核激素受體結(jié)合等分子功能起作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示核心通路有VEGF信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、催乳素信號通路等，揭示三棱-莪術(shù)藥對可能是通過以上途徑調(diào)控乳腺癌的病理進(jìn)程。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[23]。VEGF及其受體VEGFR1和VEGFR2通常在腫瘤中過度表達(dá)[24]。VEGFR2已被證明可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移以及血管通透性。這些效應(yīng)是通過各種信號通路的下游激活介導(dǎo)的，包括PI3K通路、MAPK細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路等[25]。乳腺癌常伴有炎癥過程，產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，TNF-α屬于TNF超家族，由19種蛋白質(zhì)組成，具有激活、分化、存活和細(xì)胞死亡等多種生物學(xué)功能。microRNA (miRNA)是一類重要的內(nèi)源性非編碼小RNA(21-25個核苷酸長)，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，特別是miRNA-23b和miRNA-27b與人類乳腺癌的預(yù)后不良相關(guān)，TNF-α通過AKT/NF-κB信號通路刺激兩種miRNA的表達(dá)[26]。TNF-α在激活其受體后通過一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)胞生長、侵襲或增殖，即TNF-α受體1和2(TNFR1/2)，以激活NF-κB信號傳導(dǎo)途徑，亦可激活JNK、MAPKs、AKT信號通路[27]。p53是第一個被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，具有消除和抑制細(xì)胞增殖、防止異常細(xì)胞的生長的功能，從而影響腫瘤的發(fā)展[28]。催乳素(PRL)是一種蛋白質(zhì)激素，由垂體前葉腺嗜酸細(xì)胞分泌，研究表明乳腺癌患者體內(nèi)的血清催乳素水平會明顯升高，催乳素可以提高乳腺組織對致癌因素的敏感性[29]。PRL與PRLr結(jié)合可增加乳腺癌細(xì)胞(BCC)侵襲和惡性淋巴細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致化療耐藥[30]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測了三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌的有效活性成分、關(guān)鍵靶點及作用機(jī)制，闡明了三棱-莪術(shù)藥對通過常春藤皂苷元、芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇等7個有效活性成分，作用于JUN、CASP3、PTGS2等核心靶點，干預(yù)VEGF、TNF、p53、催乳素等信號通路，影響類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、核激素受體結(jié)合，從而調(diào)控乳腺癌的病理進(jìn)程。分子對接技術(shù)提示該藥對的有效活性成分與乳腺癌的疾病靶點可產(chǎn)生較好的結(jié)合活性，其中PTGS2與常春藤皂苷元、芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇之間的結(jié)合活性可能為三棱-莪術(shù)藥對抗乳腺癌的重要機(jī)制之一。三棱-莪術(shù)藥對可以通過多成分、多靶點、多通路的方式抗乳腺癌的病理進(jìn)程，該研究能夠為乳腺癌的臨床防治提供一定的理論依據(jù)。