田璇，劉宇，朱文卿，鄭振佳

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍藥屬木本植物，有“花中之王”的美譽(yù)，是較好的天然營養(yǎng)保健資源，其中鳳丹牡丹花被國家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)為新食品原料[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)牡丹具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗血栓和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等作用[3-6]，牡丹花具有清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫，保護(hù)DNA，防止低密度脂蛋白氧化損傷等作用[7-9]，其主要抗氧化物質(zhì)是黃酮類和花色苷類成分[10-11]，分析其黃酮、花色苷類成分需要多種對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，成本較高。前期有研究嘗試通過高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析牡丹花中的部分成分[12]，但無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)其抗氧化活性成分的同步篩選。

高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是速度快、靈敏度和選擇性高，目前在食品和中藥方面已有較多應(yīng)用[13-15]。基于1,1-二甲苯-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhdrazyl，DPPH)在線清除結(jié)合高分辨質(zhì)譜鑒定抗氧化成分的方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中抗氧化成分的快速篩選與鑒定[16-19]。該方法的主要流程為抗氧化成分與自由基反應(yīng)在517 nm處形成負(fù)峰，結(jié)合高分辨質(zhì)譜獲得的精準(zhǔn)分子量進(jìn)行化合物的鑒定，從而實(shí)現(xiàn)樣品中抗氧化成分的快速、定向和準(zhǔn)確識(shí)別。

本研究以牡丹花為研究對(duì)象，在線篩選鑒別其抗氧化成分，為牡丹花的成分分析及其資源利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

牡丹花干制品(山東省菏澤市康普生物科技有限公司)。DPPH(美國Sigma公司)，乙腈(色譜純，瑞士Oceanpak公司)，純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Rigol L-3000泵(北京普源精電科技有限公司)，Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司)，Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀(美國沃特世公司)和Bruker impact Ⅱ高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國布魯克科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品與DPPH反應(yīng)液的制備

牡丹花粉碎后過80目篩，精密稱取1.0 g樣品，加入80 mL 95%乙醇溶液回流提取30 min，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用95%乙醇定容，混勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，冷藏貯存。

將DPPH用80%乙腈溶解并配制成溶液，濃度為6×10-5mol/L，備用。

1.3.2 牡丹花中抗氧化成分在線篩選與分析

采用UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)牡丹花樣品進(jìn)行在線抗氧化成分篩選。實(shí)驗(yàn)流程參照文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行改良，樣品經(jīng)過色譜柱分離后與L-3000泵輸出的DPPH溶液混合，混合液在反應(yīng)池中反應(yīng)后流入圖像二極管陣列檢測器(DAD,photo-diode-array-detector)進(jìn)行檢測。鑒于DPPH自由基在517 nm處被抗氧化活性成分清除后形成倒峰，對(duì)比樣品最佳吸收波長下的液相圖和DPPH自由基反應(yīng)后的液相圖可以篩選出抗氧化成分，結(jié)合獲取的精準(zhǔn)分子量，實(shí)現(xiàn)牡丹花中抗氧化成分的在線篩選與鑒定。

1.3.3 儀器及工作條件

液相色譜工作條件：色譜柱Waters X-Bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)-水(0.1%甲酸)，梯度洗脫程序 0～6 min(5%～10%A)，6～7 min(10%～12%A)，7～22 min(12%A)，22～27 min(12%～13%A)，27～28 min(13%～19%A)，28～45 min(19%～20%A)，45～60 min(30%～35%A)；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫25 ℃。

DPPH溶液反應(yīng)條件：反應(yīng)器為PEEK盤管(10 m×0.25 mm)，流動(dòng)相為DPPH-甲醇溶液。

質(zhì)譜工作條件：分別采用電噴霧正、負(fù)離子模式；全掃描范圍m/z50～1 500，離子源ESI，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化氣壓0.2 MPa，干燥氣流速8 L/min，干燥氣溫度200 ℃，碰撞能量90 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

以乙腈-水(0.1%甲酸)為流動(dòng)相，進(jìn)行分析條件的摸索。分別考察了等度洗脫和梯度洗脫在不同檢測波長下對(duì)牡丹花樣品的分離情況。實(shí)驗(yàn)表明等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)樣品中化合物的有效分離，采用梯度洗脫的方式可以實(shí)現(xiàn)牡丹花樣品中多組分的有效分離。分析過程中分別比較了280 nm和350 nm下樣品的吸收情況和出峰數(shù)量，結(jié)果顯示280 nm下樣品中的響應(yīng)值較好，色譜峰數(shù)量多于350 nm。因此，液相分析條件選用乙腈-水(0.1%甲酸)為流動(dòng)相，在280 nm下進(jìn)行梯度洗脫的分析條件。

2.2 抗氧化活性成分在線篩選

高效液相色譜儀進(jìn)行抗氧化活性成分的篩選，其液相色譜分析結(jié)果見圖1。圖1(a)為牡丹花樣品的高效液相色譜圖，圖1(b)為在線清除自由基液相色譜圖，根據(jù)圖1(b)結(jié)果顯示牡丹花提取物中的化合物6、8、10、14和15共5種成分具有抗氧化活性。

圖1 牡丹花與在線清除自由基的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of peony flower and on-line free radical scavenging

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別考察正、負(fù)兩種離子模式下待測樣品的總離子流圖，分析結(jié)果見圖2。對(duì)總離子流圖進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，牡丹花中的主要待測組分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值略高于正離子模式，在負(fù)離子模式下雜質(zhì)的干擾程度低于正離子模式。因此為獲得最佳的分析結(jié)果，本研究選取負(fù)離子模式為牡丹花成分分析的質(zhì)譜條件。

圖2 正負(fù)離子模式下牡丹花樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram in positive and negative ion modes of peony flower samples

2.4 牡丹花組分及其抗氧化成分的鑒定

在優(yōu)化后的色譜分析條件下，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)牡丹花中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。根據(jù)獲得的化合物的精確分子量信息與參考文獻(xiàn)相對(duì)比，進(jìn)行化合物的推測，結(jié)果見表1。參考相關(guān)文獻(xiàn)[21-22]與牡丹中已知組分推測白牡丹花中具有抗氧化成分依次為6(沒食子酸乙酯)、8(未知)、10(11α,12α-epoxy-3β,23-dihydroxy-30-norolean-20(29)-en-28,13β-olide)、14(未知)和15(未知)共5種成分，其中3種未知組分有待于今后通過分離純化獲得單體后進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

表1 牡丹花樣品的HPLC-Q-TOF-MS分析

表1(續(xù))

化合物1在負(fù)離子模式下得到的分子量為331.055 4，推測為1-沒食子酸酰葡萄糖或6-沒食子酸酰葡萄糖[23-24]?；衔?在負(fù)離子模式下得到的分子量為609.111 8，推測為山奈酚-3,7-二-O-葡萄糖苷或山柰酚3-O-β-D-半乳糖(2→1)-β-D-葡萄糖苷[25-26]?；衔?和11在負(fù)離子模式下得到的分子量分別為447.064 3和447.064 6，推測可能為木犀草素-7-O-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[25,27]，與參考文獻(xiàn)[27]獲得的色譜峰進(jìn)行對(duì)照，確定化合物11為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，因此判斷化合物9為木犀草素-7-O-葡萄糖苷?；衔?2在負(fù)離子模式下得到的分子量為577.118 2，推測該化合物為芹菜素-7-O-新橘皮糖苷或芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4′-O-α-L-鼠李糖苷[27-28]。

對(duì)于同分異構(gòu)體，由于幾種化合物分子量相同，且沒有參考文獻(xiàn)報(bào)道，即使通過多級(jí)質(zhì)譜也難以實(shí)現(xiàn)鑒定。后期可以考慮在獲得單體后進(jìn)行進(jìn)一步分析，特別是通過核磁共振中HMBC、HSQC和1H-1H-COSY等二維核磁進(jìn)行最終確認(rèn)。

3 結(jié)論

本研究依據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得的精準(zhǔn)分子量，共鑒定了15種成分并在線篩選出5種具有抗氧化活性的物質(zhì)，參考現(xiàn)有文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其中僅有沒食子酸乙酯和11α,12α-epoxy-3β,23-dihydroxy-30-norolean-20(29)-en-28,13β-olide兩種成分在牡丹成分研究中報(bào)道過，其他抗氧化組分均為首次發(fā)現(xiàn)，有待于后期結(jié)合分離技術(shù)和核磁等結(jié)構(gòu)確證技術(shù)進(jìn)一步鑒定。此外，鑒定的其他組分多為黃酮類化合物，理論上也具有清除DPPH的效果，通過該模型未能體現(xiàn)其在線清除DPPH的特性，該現(xiàn)象也有待于后期通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。