李樹根,馮大雄，汪在德，劉志強(qiáng)

脊柱是骨關(guān)節(jié)結(jié)核的主要發(fā)病部位，脊柱結(jié)核具有發(fā)病隱匿的特點(diǎn)，患者就醫(yī)時(shí)通常已發(fā)展至中晚期，出現(xiàn)脊柱失穩(wěn)、畸形、癱瘓等癥狀[1]。目前，臨床治療脊柱結(jié)核的主要方法為手術(shù)治療加抗結(jié)核的綜合療法，但患者存在難治、術(shù)后結(jié)核復(fù)發(fā)、耐藥等情況，使脊柱結(jié)核防治受限[2]。因此，臨床需對(duì)脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)的相關(guān)因素進(jìn)行深入研究，根據(jù)便于獲取、且較可靠的指標(biāo)對(duì)脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測。Toll樣受體(TLRs)是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體及病原模式識(shí)別受體之一，臨床關(guān)于骨關(guān)節(jié)結(jié)核及其易感因素的研究主要集中于TLRs信號(hào)正反饋傳導(dǎo)通路[3]。有研究表明，肺結(jié)核患者外周血中白細(xì)胞介素-17(IL-17)表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，提示IL-17可能參與結(jié)核的病理過程[4]。Toll作用蛋白(Tollip)在發(fā)揮作用時(shí)需與Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合來產(chǎn)生對(duì)TLR相關(guān)應(yīng)答的抑制作用[5]。本研究旨在探究脊柱結(jié)核患者外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年1—12月我院收治的脊柱結(jié)核96例的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)檢查、病理檢查確診為脊柱結(jié)核[6]者；年齡>18歲者；未接受抗結(jié)核治療或手術(shù)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料缺失者；合并惡性腫瘤者；合并心腦血管疾病者；合并骨代謝疾病者，如骨質(zhì)疏松癥、遺傳性骨病等；合并其他部位感染者；合并自身免疫性疾病者；合并肺部或其他部位活動(dòng)性結(jié)核者；需長期使用影響免疫功能的藥物者。將96例脊柱結(jié)核作為觀察組，選擇同期來我院進(jìn)行體檢的健康者40例作為對(duì)照組，2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 采集2組清晨空腹外周靜脈血6 ml，將采集的血液置于EDTA抗凝管中，并于-80 ℃低溫冷凍保存。取靜脈血2 ml，按照全血RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測定RNA含量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法獲取TLR4、IL-17及Tollip mRNA的擴(kuò)增曲線并使用2-ΔΔCt計(jì)算各樣本中的mRNA含量，ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.3觀察指標(biāo) 檢測并分析2組受試者外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量，使用受試者工作特征(ROC)曲線分析外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表達(dá)對(duì)脊柱結(jié)核患者的診斷效能。觀察組均隨訪1年，根據(jù)觀察組患者是否復(fù)發(fā)分為未復(fù)發(fā)組(n=68)及復(fù)發(fā)組(n=28)，分析2組外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表達(dá)差異，使用ROC曲線分析外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表達(dá)對(duì)脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的預(yù)測效能。

2 結(jié)果

2.1外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平比較 觀察組外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平均高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平比較

2.2外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者的診斷效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者的診斷效能均較高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者的診斷效能分析

2.3未復(fù)發(fā)組與復(fù)發(fā)組外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平比較 復(fù)發(fā)組外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平均高于未復(fù)發(fā)組(P<0.01)。見表3。

表3 未復(fù)發(fā)組與復(fù)發(fā)組外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平比較

2.4外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)的預(yù)測效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)的預(yù)測效能均較高(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)的預(yù)測效能分析

3 討論

結(jié)核桿菌可侵犯絕大部分人體組織，其中肺外結(jié)核多見于骨及關(guān)節(jié)部位，而脊柱是主要的肺外結(jié)核發(fā)病部位[7]。脊柱結(jié)核早期病變常發(fā)生于椎體前下部，隨著病程進(jìn)展逐漸累及椎體中心部位和椎間盤，當(dāng)患者椎間盤發(fā)生破壞、塌陷后可導(dǎo)致脊髓壓迫，甚至截癱等嚴(yán)重后果[8]。TLRs屬Ⅰ型跨膜蛋白，可參與病原微生物及其產(chǎn)物的識(shí)別，其可將細(xì)胞外區(qū)域識(shí)別的信息傳導(dǎo)至通路下游[9]。正常情況下，人體組織的TLRs表達(dá)水平較低，當(dāng)機(jī)體受到感染，TLRs通路被激活后，則TLRs表達(dá)水平會(huì)顯著升高，且會(huì)促進(jìn)炎性因子分泌[10]。IL-17是CD4+ T淋巴細(xì)胞亞群Th17分泌的細(xì)胞因子，其可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞分化，刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)及趨化因子，導(dǎo)致炎癥[11]。Tollip基因可維持機(jī)體正常免疫系統(tǒng)的平衡，且對(duì)機(jī)體感染后的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有調(diào)節(jié)作用[12]。本研究結(jié)果顯示，脊柱結(jié)核患者外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平高于健康者，其機(jī)制可能為患者受到結(jié)核桿菌感染后，TLR4信號(hào)通路激活產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使大量炎性因子釋放，導(dǎo)致免疫應(yīng)答紊亂、炎癥增強(qiáng)、組織壞死。既往有研究認(rèn)為，感染結(jié)核桿菌的患者體內(nèi)TLR4、Tollip均處于異常水平[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-17參與了脊柱結(jié)核患者的免疫應(yīng)答，且在脊柱結(jié)核病灶的形成、病情進(jìn)展中均發(fā)揮作用[14]。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者的診斷效能均較高。

TLR4主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面，其信號(hào)通路在抗結(jié)核桿菌的免疫應(yīng)答、遺傳易感性、診療方面均有重要作用[15]。IL-17參與了結(jié)核病患者抗感染免疫的介導(dǎo)過程，對(duì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞生成和募集、加強(qiáng)干擾素-γ的保護(hù)性反應(yīng)、促進(jìn)肉芽腫形成均有較顯著的作用[16]。目前臨床認(rèn)為，Tollip不僅通過TLR信號(hào)發(fā)揮抗炎作用，還可影響免疫細(xì)胞功能、參與細(xì)胞凋亡，而Tollip mRNA缺乏則可能使患者結(jié)核感染的風(fēng)險(xiǎn)提高[17]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平均高于未復(fù)發(fā)組，提示TLR4、IL-17及Tollip mRNA可能參與脊柱結(jié)核的復(fù)發(fā)。此外，本研究ROC曲線分析顯示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平對(duì)脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)的預(yù)測效能均較高，說明上述指標(biāo)均對(duì)預(yù)測脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)有一定意義。

綜上所述，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表達(dá)水平可用于診斷脊柱結(jié)核，且對(duì)預(yù)測患者是否復(fù)發(fā)有一定價(jià)值。