王 艷，況 蕾，王 晴，武宸宇，張 蓓

宮頸癌是我國(guó)婦女常見的女性生殖道惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、發(fā)現(xiàn)不及時(shí)、治療手段有限和預(yù)后差等特點(diǎn)。目前宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)患者與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關(guān)。越來越多的研究表明，自噬功能異常亦參與宮頸癌的發(fā)病[1]。自噬是一種常見的程序性死亡，是自噬溶酶體降解大部分胞質(zhì)內(nèi)容物的一種分解代謝過程。Beclin-1和LC3能夠分別參與自噬形成的最初階段和自噬泡的延長(zhǎng)、閉合，是自噬活性的經(jīng)典指標(biāo)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，HPV-16 E6/E7能通過加速宮頸癌細(xì)胞起始階段的自噬通量來維持適當(dāng)激活的自噬，即在癌變?cè)缙陔A段，HPV會(huì)反饋性上調(diào)細(xì)胞自噬活性，具有抑制細(xì)胞癌變的作用，而隨著腫瘤體積增大或病情進(jìn)展，癌細(xì)胞增殖失控，血液供應(yīng)不足，則可能通過啟動(dòng)自噬適應(yīng)環(huán)境，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子家族-1(SIRT-1)可通過啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞自噬，促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。目前有關(guān)SIRT1、Beclin-1、LC3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義研究尚少，因而本研究擬探討上述指標(biāo)在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)1級(jí)、CIN 2～3級(jí)以及浸潤(rùn)性宮頸鱗癌標(biāo)本中的表達(dá)情況并明確其與宮頸鱗癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2014年8月—2015年8月徐州市中心醫(yī)院婦科行手術(shù)治療后經(jīng)病理科存檔的標(biāo)本患者為研究對(duì)象，包括正常宮頸組織、CIN 1級(jí)、CIN 2～3級(jí)及宮頸鱗癌組織各50例。其中正常宮頸組織取自因子宮肌瘤或其他非宮頸疾病行子宮全切術(shù)的住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：組織病理學(xué)診斷明確；有剩余組織可供行免疫組化染色。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸鱗癌患者術(shù)前接受放療、化療等治療；術(shù)后失訪；臨床或病理資料無法分析者。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集：通過電子病歷系統(tǒng)收集宮頸癌患者的臨床和病理資料，包括年齡、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期、腫瘤分化程度(高分化、中低分化)、HPV-16/18感染狀態(tài)以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。對(duì)所有患者行電話隨訪，隨訪終點(diǎn)為全因死亡，隨訪時(shí)間為從確診至出現(xiàn)終點(diǎn)事件或末次隨訪(2022年1月)的時(shí)間間隔。若患者失訪，則記錄末次隨訪時(shí)間和狀態(tài)為刪失數(shù)據(jù)。

1.2.2免疫組化檢測(cè)方法：將所有組織標(biāo)本石蠟包埋、每個(gè)蠟塊4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)梯度乙醇脫水后行高溫下抗原修復(fù)。滴加3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。加入兔抗人Beclin-1(Proteintech公司，11306-1-AP)、LC3 A/B(Affinity公司，AF5402)和SIRT-1(Affinity公司，df6033)，4 ℃過夜，滴加山羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體工作液，DAB顯色，封片和拍照。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)切片獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估。采用半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)細(xì)胞染色比例及強(qiáng)度分別進(jìn)行評(píng)估[5]。陽(yáng)性細(xì)胞率≤5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分別記為0、1、2、3和4分。染色強(qiáng)度無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2和3分。每張切片中至少選取10個(gè)高倍(400×)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞比例分析，每個(gè)視野中應(yīng)至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)其陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。若染色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞率得分<4分則判定為陰性，而≥4分則判定為陽(yáng)性。

1.3觀察指標(biāo) 觀察各組Beclin-1、LC3和SIRT-1免疫組化染色情況及與宮頸鱗癌臨床病理特征關(guān)系，分析上述指標(biāo)之間的相關(guān)性及影響預(yù)后的相關(guān)因素。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。宮頸鱗癌患者預(yù)后的影響因素應(yīng)用單因素和多因素Cox回歸分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1SIRT-1、Beclin-1及LC3在各類宮頸組織中的表達(dá)情況 在正常宮頸組織，SIRT-1多為陰性，而Beclin-1和LC3多為陽(yáng)性。隨著CIN的發(fā)生及進(jìn)展，SIRT-1陽(yáng)性率逐漸增高，而Beclin-1和LC3的陽(yáng)性率逐漸降低，SIRT-1、Beclin-1和LC3組間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。正常宮頸組織、CIN 1級(jí)組織、CIN 2～3級(jí)組織和宮頸鱗癌組織SIRT-1、Beclin-1和LC3陽(yáng)性表達(dá)情況見圖1。

表1 SIRT-1、Beclin-1及LC3在不同宮頸組織中的表達(dá)情況[例(%)]

2.2SIRT-1、Beclin-1和LC3表達(dá)與宮頸鱗癌臨床特征的關(guān)系 SIRT-1陽(yáng)性率在年齡≥50組、FIGO Ⅲ～Ⅳ期組、中低分化組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著升高，Beclin-1和LC3陽(yáng)性率在FIGO Ⅰ～Ⅱ期組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 SIRT-1、Beclin-1和LC3表達(dá)與宮頸鱗癌臨床特征的關(guān)系(例)

2.3宮頸鱗癌組織中SIRT-1與Beclin-1、LC3表達(dá)的相關(guān)性 宮頸鱗癌組織中SIRT-1與Beclin-1和LC3呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.62、-0.57，P<0.001)。

2.4影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析 納入的50例末次隨訪時(shí)共33例(66.0%)死亡，中位隨訪時(shí)間30(23～42)個(gè)月。單因素分析表明，年齡≥50歲、FIGO Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SIRT-1陽(yáng)性及Beclin-1陰性是宮頸鱗癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05，P<0.01)。見表3。Cox多因素分析表明，年齡≥50歲、FIGO Ⅲ～Ⅳ期和SIRT-1陽(yáng)性是宮頸鱗癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表3 影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的單因素分析(例)

表4 宮頸鱗癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素Cox回歸分析

3 討論

SIRT-1本質(zhì)上屬于脫乙酰酶，從組蛋白和非組蛋白中去除乙?；瞧渲饕飳W(xué)功能。此外，研究還表明，SIRT-1能夠通過調(diào)控眾多細(xì)胞內(nèi)因子廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡、衰老及新生血管生成等[6-7]。本研究結(jié)果顯示，SIRT-1在正常宮頸組織中表達(dá)較少，在CIN及宮頸鱗癌組織中表達(dá)明顯增加，表明SIRT-1上調(diào)可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生。張惠文等[8]證實(shí)，SIRT-1在正常宮頸、低級(jí)別CIN、高級(jí)別CIN及宮頸癌組織中的陽(yáng)性率分別為0、15.38%、37.14%和40.00%，本研究結(jié)果與其報(bào)道相似。SINGH等[9]研究亦發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的加重，SIRT-1的表達(dá)水平亦逐步上調(diào)。

SIRT-1與宮頸鱗癌組織分化程度低、FIGO分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，提示其可能參與了宮頸鱗癌的組織分化、轉(zhuǎn)移等重要的病理生理學(xué)過程。WANG等[10]研究表明，SIRT-1表達(dá)與HPV-16 E7蛋白呈顯著正相關(guān)，敲除SIRT-1后宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)能力顯著降低。另有研究表明，敲除SIRT-1后能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，而其本身能夠抑制宮頸癌細(xì)胞對(duì)HPV的抵抗力[11]。

Beclin-1是自噬調(diào)控基因，能夠與Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶結(jié)合，形成能夠與多種蛋白質(zhì)相互調(diào)節(jié)的核心復(fù)合體參與細(xì)胞自噬的調(diào)控。LC3分為L(zhǎng)C-3A和LC-3B兩種亞型，前者于細(xì)胞質(zhì)中常規(guī)表達(dá)，后者在細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)表達(dá)于自噬體膜上。有學(xué)者通過Western Blot方法證實(shí)Beclin-1和LC-3蛋白含量隨著宮頸CIN病變嚴(yán)重程度的增加而逐漸下降[12]，本研究結(jié)果與其一致。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1、LC-3與宮頸癌FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與CHENG等[13]報(bào)道結(jié)果一致。然而，ZHU等[14]報(bào)道Beclin-1、LC-3與FIGO Ⅰ～Ⅱ期宮頸鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理學(xué)特征無明顯相關(guān)性。本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)，Beclin-1與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，但是其在多因素分析中并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能為本研究樣本量較少等因素導(dǎo)致。既往有大量文獻(xiàn)報(bào)道，Beclin-1和LC3等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平與多種惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)[15-17]，孟志英等[18]發(fā)現(xiàn)，Beclin-1陽(yáng)性的宮頸癌患者生存期長(zhǎng)于Beclin-1陰性者。因此未來有必要增加樣本量對(duì)Beclin-1與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系作進(jìn)一步探討。

綜上所述，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的進(jìn)展，SIRT-1表達(dá)量明顯增加，而自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3表達(dá)顯著下降，三者與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，且SIRT-1高表達(dá)與宮頸鱗癌預(yù)后不良有關(guān)。提示SIRT-1、Beclin-1和LC3在宮頸鱗癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色，可能作為評(píng)估宮頸鱗癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。