張文成 王良發(fā) 章慧玉 靳海蕾 張志方 李長建 張守林

（鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南 鶴壁 458030）

玉米（Zea may L.）作為世界上最重要的糧食、飼料和能源作物之一，在保障我國糧食安全、促進經(jīng)濟發(fā)展及緩解能源危機等方面發(fā)揮著不可替代的作用[1]。近年來，極端災(zāi)害天氣頻發(fā)，玉米病害及熱害已經(jīng)嚴(yán)重威脅黃淮海地區(qū)玉米生產(chǎn)。

受熱帶氣旋活動影響，以前主要在我國臺灣、海南、廣東、福建等省發(fā)生的玉米南方銹病，現(xiàn)已成為黃淮海夏玉米區(qū)突發(fā)性、暴發(fā)性、生產(chǎn)危害性極大的病害[2]。2015年和2021年，黃淮海地區(qū)大面積暴發(fā)了玉米南方銹病，產(chǎn)量損失嚴(yán)重，玉米南方銹病在我國由次要病害上升為主要病害[3]。對南方銹病抗性QTL和基因的鑒定與定位研究也在不斷地跟進。我國科研工作者利用抗南方銹病玉米自交系材料和感病材料進行遺傳分析，定位到多個玉米抗南方銹病主效基因位點，大多數(shù)位于10號染色體短臂[4-7]。最近，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)丁俊強教授課題組定位并克隆到一個玉米抗南方銹病主效基因RppC，并解析了RppC蛋白的抗病機理[8]。通過與感病材料Lx9801序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因在Lx9801中存在多處變異，其中一個A堿基的插入導(dǎo)致RppC翻譯提前終止。利用轉(zhuǎn)基因方法驗證了RppC的抗病效應(yīng)。對從我國玉米主產(chǎn)區(qū)分離的577份田間病原菌進行測序分析，發(fā)現(xiàn)RppC能識別83.5%的AvrRppC結(jié)構(gòu)位點，從而對當(dāng)前南方銹病病原菌優(yōu)勢小種產(chǎn)生抗病反應(yīng)，表明RppC是一個優(yōu)異的抗病基因資源。并針對抗病材料CML496和感病材料Lx9801在RppC基因序列上的差異，設(shè)計特異引物用于檢測RppC基因，若能擴增出條帶，則為CML496-RppC類型。

玉米籽粒產(chǎn)量是一復(fù)雜的綜合性狀，直接受穗長、穗粗、行粒數(shù)、穗行數(shù)、粒長等影響。然而穗長、穗粗、行粒數(shù)、穗行數(shù)、粒長等性狀又受到穗分化時花序分生組織（Inflorescence Meristem）活性影響[9-10]。玉米行粒數(shù)作為重要的產(chǎn)量構(gòu)成因子之一，增加行粒數(shù)，可使單穗產(chǎn)量增加。迄今為止已鑒定出多個玉米穗長相關(guān)的QTL，但僅有少數(shù)基因被克隆，基因KNR6和YIGE1可通過調(diào)控穗長、行粒數(shù)來提高玉米產(chǎn)量[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，基因ZmACO2并不是直接通過調(diào)控行粒數(shù)來提高玉米產(chǎn)量，而是通過提高玉米幼穗頂部雌花育性來提高玉米產(chǎn)量[14]。基因ZmACO2是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授課題組克隆，參與花序發(fā)育進程中內(nèi)源乙烯的生物合成。敲除ZmACO2基因，雌花序中內(nèi)源乙烯的合成減少，雌性小花的敗育率下降，結(jié)實率增加，單穗籽粒數(shù)增加，同時敲除ZmACO2基因也可使雜交種增產(chǎn)約13.4%。對單倍型Ye478和單倍型SL17基因序列分析發(fā)現(xiàn)，在基因編碼區(qū)兩單倍型沒有序列差異，而是啟動子區(qū)域4個SNP和1個InDel差異與敗育率關(guān)聯(lián)度高。啟動子結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致單倍型Ye478的ZmACO2基因表達少于單倍型SL17，從而引起乙烯及相關(guān)植物激素在兩單倍型中表達差異，最終導(dǎo)致Ye478行粒數(shù)高于SL17、Ye478穗長度大于SL17。

鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院在玉米新品種選育過程中特別注重抗病性和結(jié)實性優(yōu)異種質(zhì)的選育。鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米種質(zhì)具有優(yōu)良的結(jié)實性，在此基礎(chǔ)上，近年來從我國南方引進了一批抗病種質(zhì)材料。利用不同生態(tài)區(qū)域選育父本群和母本群的方法，選育出一批結(jié)實性好、抗病性強的優(yōu)良玉米自交系，并組配出一批優(yōu)良玉米新品種通過國家、省級試驗審定。為了探究鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米種質(zhì)抗病性強、結(jié)實性好、配合力高的分子機理，特選用河南農(nóng)業(yè)大學(xué)丁俊強教授課題組報道的抗南方銹病主效基因RppC特異引物、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授課題組報道的乙烯合成關(guān)鍵酶基因ZmACO2啟動子區(qū)特異引物對鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院骨干系材料進行擴增、測序分析，找到相應(yīng)的抗南方銹病、高結(jié)實率材料，便于以后分子標(biāo)記輔助選擇育種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用20份鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自選系、1份蘇艾自交系MD15及鄭58、昌7-2、掖478為供試材料（表1）。

1.2 檢測引物

參考Ce Deng等[8]發(fā)表的論文，選取表2中特異引物檢測供試材料抗南方銹病基因RppC和調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動子區(qū)。

表2 試驗所用引物名稱及序列

1.3 試驗方法

2022年6 月，在鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園區(qū)種植玉米試驗材料。7片展開葉時采集葉片，采用TPS法提取DNA。利用抗南方銹病基因RppC和調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動子區(qū)特異引物進行PCR擴增。取8 μl擴增產(chǎn)物電泳檢測目的條帶。將有擴增產(chǎn)物的對應(yīng)PCR反應(yīng)液送生工生物公司測序。

運用Dnaman軟件進行序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

抗南方銹病主效基因RppC擴增見圖1，圖1中編 號1～24對 應(yīng) 表1中1～24號 自 交 系。利 用CML496-allele-speicific-F/R引物對24個玉米自交系進行PCR擴增，其中浚5036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚M9、浚351、浚JC125、MD15均擴增出588 bp條帶（圖1）。測序結(jié)果顯示，12個自交系材料擴增序列與參考CML496-RppC基因特異序列完全一致（圖2）。CML496-allele-speicific-F/R特異擴增抗南方銹病主效基因CML496-RppC原理見圖2。在所選取的全部24個優(yōu)良自交系中，有50.0%的材料具有RppC優(yōu)異抗南方銹病基因資源；在所選取鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院20個骨干材料中，有55.0%的自交系含有RppC抗性基因。

表1 供試材料及所屬類群

調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動子區(qū)PCR結(jié)果見圖3，除浚SN12E、浚96、浚313、MD15、鄭58外，其他19個材料均擴增出1 300 bp左右的目的條帶。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，所選取19個自交系的ZmACO2基因上游啟動子區(qū)分為2種基因型，以掖478、浚M98為代表的見圖4。與掖478序列相同的有浚5036、浚6366、浚6368、浚9058、浚6313、浚50X、浚3138、浚58、浚208A、浚3665、浚728、浚M9、浚G6Y6-2；與浚M98序列相同的有浚97、浚351、浚JC125、昌7-2。

3 討論與結(jié)論

玉米南方銹病由多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）引起的真菌性病害，近年來，已成為黃淮海地區(qū)主要病害之一，導(dǎo)致部分地區(qū)玉米大幅減產(chǎn)[13]。尤其是2021年，黃淮海地區(qū)鄭單958較早感南方銹病，產(chǎn)量銳減。通過考察各試驗點參試品種，大多數(shù)品種均不同程度遭受南方銹病侵染，只有少數(shù)品種表現(xiàn)出較好的抗性。說明黃淮海地區(qū)育種家培育的抗南方銹病種質(zhì)資源較少，開展抗南方銹病優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制研究迫在眉睫。選育抗南方銹病種質(zhì)是最經(jīng)濟、安全的應(yīng)對方式。2003年，?？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（2009年更名為鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院）承擔(dān)國家黃淮海夏玉米區(qū)域試驗，國外的M118和M119兩個品種在試驗中株型比較緊湊，與國內(nèi)參試品種株型差異較大?？？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所在2004年夏天對2個雜交種選優(yōu)株進行套袋自交，然后通過南繁北育、異地逆境選擇，從M119中選育出優(yōu)良自交系浚M9。用浚M9已經(jīng)組配出國審和省審品種浚單509、浚單3136、永優(yōu)618，均表現(xiàn)出高抗南方銹病。由于浚M9的一般配合力較高、抗南方銹病強的特點，鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種家利用群內(nèi)改良的方法，將浚926（源于昌7-2和京7黃二環(huán)系）與浚M9雜交選育出浚M98、浚M97、浚96等系列高配合力自交系。但從大田生產(chǎn)觀察到，浚M98、浚M97、浚96抗南方銹病能力不如浚M9，利用抗南方銹病主效基因CML496-RppC特異引物對CML496-allele-speicific-F/R在浚M98、浚M97、昌7-2上沒有擴增出特異條帶，推測浚M98、浚M97、浚96的RppC基因區(qū)段可能源自昌7-2。鄭58、昌7-2均沒有抗南方銹病CML496-RppC類型基因。從大田抗性觀察，鄭單958抗南方銹病較差。特異引物對CML496-allele-speicific-F/R能擴增出CML496-RppC類型基因序列，得到啟示可以利用浚M9（塘四平頭）為供體，以CML496-allele-speicific-F/R為分子標(biāo)記，對昌7-2、浚M98、浚M97、浚M96進行精準(zhǔn)回交改良?？?036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚351、浚JC125是鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院近年來新選育的優(yōu)良自交系，大多數(shù)材料均利用先玉366的二環(huán)系與其他材料雜合選育而來。這個二環(huán)系主要優(yōu)點是株型較好、抗病性強，推測上述材料的抗南方銹病基因源于先玉366二環(huán)系。MD15是福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所和貴州省農(nóng)科院旱糧所合作選育的Suwan-Iodent（蘇艾）種質(zhì)自交系，目前在黃淮海地區(qū)已經(jīng)組配出多個組合，具有較好的抗病性和抗逆性，蘇艾熱帶種質(zhì)可以作為黃淮海玉米育種的抗源供體[14-16]。

玉米結(jié)實性受花粉活力、花絲活力及雌花育性影響。對浚單系列玉米花絲活力研究表明，浚單系列玉米在吐絲后6 d授粉，花絲活力與對照相當(dāng)，之后活力下降[17-18]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院對浚M9進行花粉耐高溫鑒定，結(jié)論是優(yōu)于對照。在本試驗中，除5個自交系外，其他19個自交系調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動子區(qū)PCR均擴增目標(biāo)條帶（圖3）。將這5個自交系用玉米actin特異引物擴增，均擴增出相應(yīng)條帶，推測在這5個自交系G49-3-F/R引物區(qū)可能存在堿基變異，導(dǎo)致G49-3-F/R引物不能配對。掖478具有較低的敗育率，從而使行粒數(shù)增加、穗長增加。調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動子區(qū)PCR及測序顯示，13個自交系序列與掖478一致。這些自交系主要為瑞德、改良瑞德類，在育種上主要作為母本材料利用，制種產(chǎn)量較高。表明鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜交玉米結(jié)實性好是有多方面因素的，既有母本雌花育性高，又有父本花粉活力高，這些性狀很好的遺傳給了雜交后代。與浚M98序列一致的除浚351是PB種質(zhì)，其他3個均是塘四平頭種質(zhì)，這也可能是生產(chǎn)上觀察到部分作父本材料的塘四平頭種質(zhì)雌穗稍短的原因。當(dāng)然，玉米穗長、行粒數(shù)受多個基因調(diào)控，本課題組將持續(xù)關(guān)注國際研究最新進展，以便將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為應(yīng)用研究，培育出更多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)玉米新品種。