蔣沈君 吳辛剛 王思平 徐葉峰 劉云霞

杭州市第三人民醫(yī)院 杭州 310009

骨肉瘤是骨骼最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率約為3/100萬[1]，我國每年新增病例約0.65萬例[2]。骨肉瘤細(xì)胞多呈高度惡性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，約80%～90%的患者確診時就同時存在潛在轉(zhuǎn)移灶，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移大多在肺，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低于20%[3]。因此，肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤治療失敗的最常見原因，也是現(xiàn)階段骨肉瘤治療領(lǐng)域的瓶頸和最重要的突破方向。骨肉瘤屬于中醫(yī)“骨瘤病”范疇，機體正氣虧耗，濁邪隨經(jīng)走絡(luò)，深入骨髓，導(dǎo)致氣虛血瘀，傷筋蝕骨，結(jié)毒成瘤，繼而客于臟腑，日久成積，致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移以肺氣虛為本，痰阻為標(biāo)，形成骨肉瘤細(xì)胞易于生長的肺組織微環(huán)境，最終成為腫瘤細(xì)胞定植生長的“沃土”。本課題組在既往臨床研究中，采用補肺湯（出自《永類鈐方》）加減配合化療防治骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移，獲得較好的臨床療效[4]，但作用機制尚不明確。本研究以大鼠骨肉瘤細(xì)胞為對象，研究補肺湯對骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控作用，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR-106細(xì)胞株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、鏈霉素100 U·mL-1、青霉素100 U·mL-1的洛斯維爾帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，1～2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2 主要藥物與試劑 補肺湯由6味中藥組成，生黃芪30 g（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號：210304）、黨參10 g（產(chǎn)地甘肅，批號：201224）、五味子6 g（產(chǎn)地遼寧，批號：210227）、熟地黃15 g（產(chǎn)地河南，批號：210221）、紫菀10 g（產(chǎn)地河北，批號：201203）、桑白皮10 g（產(chǎn)地浙江，批號：210119），所有中藥飲片均購于華東醫(yī)藥股份有限公司。將中藥飲片放入煎鍋中，加5倍水，浸泡1 h，保持沸騰30 min；加3倍水，再煎20 min，過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮濾液，質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至70%，沉淀24 h，離心去沉淀，濃縮成2.0 g·mL-1的中藥水煎劑，調(diào)至pH值7.0～7.2，過濾滅菌，分裝備用。Prime Script RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司（批號：RR821A）；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR） 預(yù)混液（Power Up SYBR Green Master Mix）試劑盒購于美國Sigma公司（批號：01030034）；抗蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗體、抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體、抗磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體均購于美國Abcam公司（批號：ab32028、ab179463、ab191606）。

1.3 主要儀器 BD FACScan型流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；qTOW-ER3G IVD型Real-time qPCR儀為德國耶拿分析儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組 分為對照組和補肺湯低濃度組、補肺湯中濃度組和補肺湯高濃度組。對照組細(xì)胞以含10%胎牛血清、鏈霉素100 U·mL-1、青霉素100 U·mL-1的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；補肺湯各濃度組細(xì)胞進入對數(shù)生長期后，分別用5%補肺湯 （低濃度組）、10%補肺湯（中濃度組）、15%補肺湯（高濃度組）干預(yù)48 h。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，10%的補肺湯對骨肉瘤細(xì)胞UMR-106增殖轉(zhuǎn)移具有較強的抑制作用。因此本研究以濃度10%為中位值，選取濃度5%為低濃度組，濃度15%為高濃度組，分3個濃度階梯進行研究。

1.4.2 噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期的UMR-106細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞單層鋪滿孔底（貼壁）后，各實驗組分別加入100 mL條件培養(yǎng)液，對照組各孔加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。中藥組各孔分別加入不同濃度的補肺湯，另設(shè)6個復(fù)孔，僅含培養(yǎng)液。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔再加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 mL。培養(yǎng)4 h后吸棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL，用酶標(biāo)儀檢測490 nm和630 nm雙波長吸光度（absorbance，A）值。計算不同濃度補肺湯干預(yù)后細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=（實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.4.3 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 操作前直尺及記號筆以紫外線滅菌30 min，用記號筆在6孔板背后均勻劃橫線，橫穿過孔，每0.5～1 cm一道，保證至少3條線穿過同一孔。收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量約為5×105個/孔，細(xì)胞鋪滿孔底后，以10 μL的移液器頭垂直于橫線劃痕，洗滌3次，洗去脫落細(xì)胞，補肺湯各濃度組分別用5%、10%、15%不同濃度的補肺湯干預(yù)48 h。分別于0、24、48 h，光鏡下拍照，每組隨機取5個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測量遷移距離。在活細(xì)胞工作站下觀察并用Image J軟件測量劃痕后0、24、48 h劃痕面積，計算劃痕面積百分比（%）=(劃痕0 h劃痕面積-其余各時相點劃痕面積)/劃痕0 h劃痕面積×100%。

1.4.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 向Transwell下室各孔加入600 μL含低血清培養(yǎng)24 h的內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，上室每孔分別加入以上三組細(xì)胞濃度為2.5×105·mL-1的細(xì)胞懸液200 μL，具體操作按Corning Transwell說明書進行，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，光鏡下觀察并拍照計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.4.5 免疫印跡檢測PI3K、AKT、mTOR蛋白表達 收集干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞，提取總蛋白并以Lowry法測定蛋白濃度，上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，完成電泳后，轉(zhuǎn)膜并封閉過夜，分別加入PI3K、AKT、mTOR一抗孵育，洗滌后再加入二抗，增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）檢測，顯影定影后以凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參，采用SensiAnsys軟件分析條帶的灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.4.6 Real-timeqPCR檢測PI3K、AKT、mTOR 的mRNA表達 收集干預(yù)48 h后的各組細(xì)胞，提取總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA， 配制體系為RNA 500 ng，5×PrimeScript Mix 2 μL，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水補充至10 μL，進行熒光定量PCR，用2-ΔΔCt法計算PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達水平。所用引物均由PrimerBank網(wǎng)站設(shè)計，由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性的資料組間兩兩比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，方差不齊的資料采用Dunnett's T3法；非正態(tài)分布的資料組間比較采用非參數(shù)檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖比較 MTT結(jié)果表明，補肺湯干預(yù)48 h后，與對照組比較，補肺湯低、中、高濃度組細(xì)胞增殖率均顯著下降（P＜0.001，P＜0.0001）。 與補肺湯低濃度組比較，中、高濃度組細(xì)胞增殖率均顯著下降（P＜0.0001）。與補肺湯中濃度組比較，高濃度組細(xì)胞增殖率顯著下降（P＜0.0001）。見圖1。以上結(jié)果提示，補肺湯對UMR-106細(xì)胞增殖具有抑制作用。

圖1 各組細(xì)胞增殖比較Fig.1 Comparison of cell proliferation of each group

2.2 劃痕實驗中各組細(xì)胞遷移能力比較 劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，補肺湯低濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而中、高濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少（P＜0.0001）。與補肺湯低濃度組比較，中、高濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少（P＜0.0001）。與補肺湯中濃度組比較，高濃度組細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＜0.05）。見圖2～3。以上結(jié)果提示，中、高濃度的補肺湯能夠抑制UMR-106細(xì)胞遷移。

圖2 劃痕實驗中各組細(xì)胞遷移能力（40×）Fig.2 Migration ability of each group in scratch test（40×）

圖3 劃痕實驗中各組細(xì)胞遷移能力比較Fig.3 Comparison of migration ability of each group in scratch test

2.3 Transwell實驗中各組細(xì)胞遷移能力比較 Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，補肺湯低濃度組穿過小室的細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而中、高濃度組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.0001）。與補肺湯低濃度組比較，中濃度組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01），高濃度組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.0001）。與補肺湯中濃度組比較，高濃度組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4～5。以上結(jié)果提示，中、高濃度補肺湯能夠抑制UMR-106細(xì)胞遷移。

圖4 Transwell實驗中各組細(xì)胞遷移能力（HE染色，20×）Fig.4 Migration ability of each group in Transwell test（HE staining， 20×）

圖5 Transwell實驗中各組細(xì)胞遷移能力比較Fig.5 Comparison of migration ability of each group in Transwell test

2.4 各組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達比較 與對照組比較，補肺湯低、中、高濃度組PI3K蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，補肺湯低濃度組AKT、mTOR蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而中、高濃度組AKT、mTOR蛋白相對表達量均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001）。 與低濃度組比較，補肺湯中濃度組的AKT、mTOR蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而高濃度組AKT、mTOR蛋白相對表達量均明顯下調(diào)（P＜0.01）。與補肺湯中濃度組比較，高濃度組AKT蛋白相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而高濃度組mTOR蛋白相對表達量明顯下調(diào)（P＜0.01）。 見圖6。

圖6 各組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達比較Fig.6 Comparison of PI3K，AKT and mTOR protein expression in each group

2.5 各組PI3K、AKT、mTOR mRNA表達比較 與對照組比較，補肺湯低、中、高濃度組PI3K mRNA相對表達量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；低濃度組AKT、mTOR mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中、高濃度組AKT、mTOR mRNA相對表達量均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。與低濃度組比較，中濃度組AKT mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而mTOR mRNA相對表達量下調(diào) （P＜0.05）；高濃度組AKT、mTOR mRNA相對表達量均明顯下調(diào) （P＜0.01，P＜0.001）。與中濃度組比較，高濃度組mTOR mRNA相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而AKT mRNA相對表達量下調(diào)（P＜0.05）。 見圖7。

圖7 各組PI3K、AKT、mTOR mRNA表達比較Fig.7 Comparison of mRNA expression of PI3K，AKT and mTOR in each group

3 結(jié)論

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，年發(fā)病率為（2～3）/100萬[1]，占原發(fā)性骨腫瘤的11.7%[1]。 早期可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，大約90%的轉(zhuǎn)移發(fā)生于肺，轉(zhuǎn)移多見于2年之內(nèi)[5]。目前綜合治療下，中晚期患者5年總生存率（overall survival，OS）低于20%[6]。 肺轉(zhuǎn)移已成為骨肉瘤治療失敗及低生存的最主要原因，探尋有效安全的藥物，改變適合骨肉瘤細(xì)胞在肺組織定植的微環(huán)境，減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，已成為當(dāng)前研究的主要方向。

腎主骨生髓，骨瘤病久，由腑入臟，耗傷腎精?！端貑枴び駲C真臟論》說：“五臟受氣于其所生，傳之于其所勝，氣舍于其所生，死于其所不勝?！奔醋硬〖澳?，腎為肺之子，故而腎（骨）病及肺。肺主呼吸運動，需腎納氣來協(xié)助，腎氣充盛，才能通過肺的肅降功能將所吸清氣下藏于腎。腎氣虧虛，腎失攝納，致肺失宣肅，津液不布，痰濁內(nèi)生，痰瘀互結(jié)，癌毒邪居于肺，肺積乃成，導(dǎo)致骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。肺為貯痰之器，主通調(diào)水道，輸布津液，若肺失宣肅，則易痰濕停留。腫瘤轉(zhuǎn)移與痰濁、癌毒、血瘀、正氣密切相關(guān)，無論是津液的運行還是氣血的走行，均上達于肺，因此“貯痰之器”的肺首當(dāng)其沖地成為骨肉瘤最易轉(zhuǎn)移的臟器[7]。故在臨床實踐中，本課題組選用補肺湯防治骨肉瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

骨肉瘤患者經(jīng)化療和手術(shù)治療后脾胃損傷，失于健運，氣血生化乏源，腎精虧耗，肺氣虛弱，因此綜合治療后患者以肺腎兩虛最為常見。在腫瘤治療中，中醫(yī)治未病思想“未病先安未受邪之地”與西醫(yī)特異性地保護靶器官微環(huán)境的理念非常契合。本課題組在臨床實踐中選用《永類鈐方》的補肺湯加減配合化療防治骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移，獲得較好的療效[4]。該方由黃芪、人參（黨參代）、熟地黃、五味子、紫菀、桑白皮組成，組方特點在于肺腎雙補，無論是腎虛在先，繼而肺虛；還是肺虛在先，引起腎虛，皆可使用。人參多由黨參代，黨參具有氣陰雙補之效，與黃芪共伍，益氣養(yǎng)陰、益肺補脾，二藥同為補氣要藥，走守兼顧，益陰鼓中，強心助肺；熟地黃補腎陰，補腎納氣；紫菀溫肺下氣、化痰止咳；五味子酸溫而潤，生津澀精、斂肺滋腎；桑白皮性味甘寒，清肺降氣，諸藥共用，共奏肺腎雙補、金水相生之效。

研究發(fā)現(xiàn)，通過PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)控尿路上皮相關(guān)基因1、p53基因、miR-32及mTOR，能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8-11]。宋瑞鵬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，41.8%（82/196）的骨肉瘤組織中mTOR高表達，與血管、黏膜侵襲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期相關(guān)；且骨肉瘤早期與晚期的mTOR表達率存在顯著差異。mTOR mRNA高表達的骨肉瘤細(xì)胞，侵襲及轉(zhuǎn)移性顯著增強，而且容易發(fā)生耐藥[12]。上述研究顯示，PI3K/AKT/mTOR信號通道在骨肉瘤細(xì)胞的增殖遷移中有極其重要的作用，通過藥物靶向調(diào)控該信號通路能夠在一定程度上抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能通過PI3K/AKT信號通路抑制肺癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖[13-15]；人參皂苷能通過PI3K/AKT/mTOR自噬通路，延緩卵巢早衰，并能夠抑制肺癌侵襲[16-17]；五味子的活性成分也具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[18]。上述研究結(jié)果與本研究證實的補肺湯調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖的機制基本一致。

本研究設(shè)置補肺湯低、中、高濃度組，是為了判斷藥物作用是否具有量效關(guān)系，從而明確補肺湯臨床應(yīng)用的最佳劑量。本研究設(shè)置了5%、10%、15%終濃度作為低、中、高3個濃度梯度。如按照等比倍增關(guān)系，應(yīng)以20%終濃度作為高濃度組，前期預(yù)實驗研究發(fā)現(xiàn)在此濃度下，骨肉瘤UMR-106細(xì)胞凋亡明顯增加，不利于觀察藥物對細(xì)胞遷移的影響，因此本研究以15%作為高濃度組，確保實驗結(jié)果的可重復(fù)性和科學(xué)性。本研究發(fā)現(xiàn)補肺湯水煎劑各濃度組均能夠抑制骨肉瘤UMR-106細(xì)胞的增殖，劃痕實驗和Transwell實驗證實中、高濃度補肺湯水煎劑能夠抑制UMR-106細(xì)胞遷移。中、高濃度補肺湯還能顯著抑制AKT、mTOR蛋白和mRNA表達，且高濃度組抑制作用更顯著。由此可見，補肺湯能夠較好地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖遷移，其作用可能與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路活性相關(guān)。

綜上所述，本研究初步探討了補肺湯發(fā)揮抗骨肉瘤作用的分子機制，但補肺湯是否能夠應(yīng)用于臨床防治骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移，有待進一步深入研究。本研究探討了中醫(yī)藥靶向治療的科學(xué)內(nèi)涵和可行性，為臨床更好地應(yīng)用補肺湯提供了實驗佐證。