鄧穎云， 黃淑芹， 邱成英

(三亞市人民醫(yī)院 兒科， 海南 三亞 572000)

支氣管哮喘主要以氣道炎癥、氣道重塑及氣道反應(yīng)增高為特點(diǎn)，其病因主要有環(huán)境影響及先天遺傳等。有研究報(bào)道，兒童支氣管哮喘發(fā)病率正逐年增高[1-2]。微小RNA(miRNA)是一組18～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)控細(xì)胞的凋亡、代謝及生長[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-146a(miR-146a)、微小RNA-21(miR-21)、微小RNA-126(miR-126)參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，例如miR-146a其基因型與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的特定臨床表現(xiàn)有關(guān)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中具有一定的作用[5]；miR-21與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為糖尿病視網(wǎng)膜病變診斷的生物學(xué)標(biāo)志物[6]；而高表達(dá)的miR-126則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯乳腺癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。目前關(guān)于血清miR-146a、miR-21及miR-126表達(dá)與小兒支氣管哮喘關(guān)系的研究報(bào)道較少，本研究通過觀察miR-146a、miR-21及miR-126水平在小兒支氣管哮喘發(fā)作時(shí)的變化，探討其在小兒支氣管哮喘發(fā)作時(shí)的意義，為臨床評估小兒支氣管哮喘的病情提供思路，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料及材料

1.1.1一般資料 選取2019年1月—2022年1月兒科收治的130例哮喘發(fā)作期患兒作為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[8]中關(guān)于哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)、且處于發(fā)作期，年齡<15歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)哮喘緩解期患兒;(2)伴心臟病、呼吸衰竭的患兒;(3)伴有血液系統(tǒng)疾病;(4)合并呼吸道傳染疾病;(5)精神失?；純?。根據(jù)《支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)》[8]，將觀察組患兒再分為輕度組(n=41)、中度組(n=56)及重度組(n=33)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(倫理號KYLL-2018-11)、且家屬均簽署知情同意書。選取同期130例體檢正常的兒童作為對照組。

1.1.2主要試劑和儀器 miR-146a、miR-21、miR-126、U6引物均由美國英杰公司設(shè)計(jì)合成，TRIzol試劑購于美國英杰公司，PrimeScript RT試劑盒購于中國TaKaRa公司，Rotorgene 3000系列PCR儀購于澳大利亞悉尼科比特研究中心。

1.2 研究方法

1.2.1樣本收集 所有兒童均于清晨抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清，置于-80 ℃保存待檢。

1.2.2血清miR-146a、miR-21、miR-126水平檢測 在血清中加入TRIzol試劑提取總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用綠色PCR系統(tǒng)在Rotorgene3000系列PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)[7]，最后由Rotorgene軟件進(jìn)行miRNA和mRNA定量分析，U6為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-146a、miR-21、miR-126的相對表達(dá)水平。miR-146a上游引物序列為5′-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3′、下游引物序列為5′-CCTCGAGTATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3′，miR-21上游引物序列為5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′、下游引物序列為5′-AUCGAAUAGUGUGACUACAACU-3′，miR-126上游引物序列為5′-AGACCACAGTTTGGCAATTGG-3′、下游引物序列為5′-AGGAGAATCCTGGCACATCG-3′，U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′、下游引物序列為5′-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料

觀察組患兒男73例、女57例，年齡4～14歲、平均(9.25±4.58)歲；對照組兒童男70例、女60例，年齡4～14歲，平均(9.68±4.29)歲。2組兒童性別、年齡等基礎(chǔ)資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)

結(jié)果顯示，觀察組患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平明顯高于對照組兒童，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。觀察組不同程度哮喘患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126相對表達(dá)水平比較，輕度組<中度組<重度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 血清miR-146a、miR-21、miR-126相對表達(dá)水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度的相關(guān)性

分析結(jié)果顯示，觀察組患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表1 觀察組與對照組兒童血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平Tab.1 Comparison of serum miR-146a, miR-21, and miR-126 expression levels between

表2 觀察組不同程度哮喘患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平Tab.2 Comparison of serum expression levels of miR-146a, miR-21, and miR-126 in children with different severity asthma in

表3 觀察組患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)性Tab.3 Correlation between serum miR-146a, miR-21, miR-126 levels and severity of illness in observation group

2.4 血清miR-146a、miR-21、miR-126相對表達(dá)水平在小兒支氣管哮喘中的診斷效能

ROC分析結(jié)果顯示，血清miR-146a、miR-21、miR-126相對表達(dá)水平檢測均可用于小兒支氣管哮喘的預(yù)測，AUC為0.738、0.767、0.869(P<0.05)。見圖1和表4。

圖1 血清miR-146a、miR-21、miR-126指標(biāo)預(yù)測小兒支氣管哮喘的ROC曲線Fig.1 ROC curve of indicators for predicting bronchial asthma in children

表4 miR-146a、miR-21、miR-126在小兒支氣管哮喘中的診斷效能Tab.4 Diagnostic efficacy of miR-146a, miR-21, and miR-126 in pediatric bronchial asthma

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，常見癥狀表現(xiàn)為喘息、胸悶和呼吸困難等，可發(fā)作于各個(gè)年齡段，兒童期是哮喘的高發(fā)時(shí)段[10]。支氣管哮喘在環(huán)境污染、天氣等眾多因素的影響下，致使疾病的發(fā)生率越來越高[11]。支氣管哮喘是一種慢性疾病，需長期服用藥物控制病情，小兒患者治療依從性差，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致氣道不可逆性狹窄和氣道重建，因此，早診斷、及時(shí)有效的治療對患兒病情恢復(fù)具有較大的幫助[12]。miRNA是非小編碼RNA，臨床研究已證實(shí)miRNA與支氣管哮喘的發(fā)生密切相關(guān)[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在多種疾病中表達(dá)異常，且能間接調(diào)控炎性因子水平，并參與炎癥反應(yīng)[14]。miR-21在支氣管哮喘患者中高表達(dá)，且能夠抑制炎癥反應(yīng)，改善氣道炎癥[15]。miR-126在支氣管哮喘中表達(dá)異常，能通過優(yōu)勢轉(zhuǎn)化提高炎性因子水平，加重患者炎癥反應(yīng)，促進(jìn)支氣管哮喘的病情發(fā)展[16]。本次研究結(jié)果顯示，觀察組患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126相對表達(dá)水平明顯高于對照組兒童。提示血清miR-146a、miR-21、miR-126可能與支氣管哮喘發(fā)生有關(guān)。

qRT-PCR方法是一種有效、準(zhǔn)確的miRNA檢測方法，本研究為探討miR-146a、miR-21、miR-126水平與哮喘的發(fā)病機(jī)制關(guān)系，采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對觀察組和對照組兒童血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-21、miR-126在觀察組患兒中的表達(dá)均高于對照組(P<0.001)，且不同病情程度患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平輕度組<中度組<重度組(P<0.05)。提示miR-146a、miR-21、miR-126與支氣管哮喘的發(fā)生的確有關(guān)系，且還可提示疾病嚴(yán)重程度，但具體的作用機(jī)制尚不明確，可能與DNA損傷、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或免疫應(yīng)答等有關(guān)[17-18]。

為進(jìn)一步研究血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與支氣管哮喘患兒的關(guān)系，本次研究分析了血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與支氣管哮喘嚴(yán)重程度的相關(guān)性，結(jié)果顯示，觀察組患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與病情程度呈正相關(guān)(P<0.05)，提示血清miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平與患兒病情程度有關(guān)，miR-146a、miR-21、miR-126表達(dá)水平越高病情越重。有研究表明，與正常兒童比較，哮喘患兒的miR-146a水平明顯升高，表明miR-146a與哮喘的發(fā)病相關(guān)[19]。還有研究表明，miR-21表達(dá)與病情嚴(yán)重程度和炎性因子活化程度有關(guān)，且對早期診斷支氣管哮喘具有一定價(jià)值。另外，miR-126在哮喘炎癥反應(yīng)中有一定的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制miR-126的表達(dá)，抑制細(xì)胞釋放出炎癥細(xì)胞因子，減少氣道黏液的分泌量，進(jìn)而緩解哮喘的急性發(fā)作[20-21]。在國外動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，卵清蛋白誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建哮喘模型后，小鼠呼吸道組織中miR-126水平明顯升高，且炎癥水平等也出現(xiàn)升高現(xiàn)象，在小鼠癥狀緩解后，miR-126水平隨之下降[22]。這一結(jié)果與本次研究結(jié)果相似。本研究經(jīng)ROC分析證實(shí)miR-146a、miR-21、miR-126均可用于小兒支氣管哮喘的預(yù)測，AUC為0.738、0.767、0.869(P<0.05)。提示miR-146a、miR-21、miR-126對早期診斷支氣管哮喘具有一定的價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小兒支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清miR-146a、miR-21、miR-126高表達(dá)，表達(dá)水平與病情程度呈正相關(guān)，均可用于小兒支氣管哮喘的預(yù)測。但本次研究樣本量較少，且只針對哮喘發(fā)作期患兒進(jìn)行研究，缺乏對持續(xù)期、緩解期患兒的研究結(jié)果，還需多方面進(jìn)行研究，以提高研究的準(zhǔn)確性。