馬 駿，陳發(fā)元，孫智榮，王茂勝，黃 鴻，夏志林，郭亞利

(1.貴州省煙草公司黔西南州公司技術(shù)中心，貴州 興義 562400；2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；3.中低品位磷礦及其共伴生資源高效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550016)

0 引言

煙堿(尼古丁)作為煙草生物堿的主要成分，在煙葉中含量占1%～3%，是煙葉總生物堿的90%～95%。煙葉中的大部分煙堿能與有機(jī)酸結(jié)合形成有機(jī)鹽，只有一小部分以游離形態(tài)存在。煙堿的含量是衡量煙葉質(zhì)量的重要因素。影響煙堿含量的主要因素有煙草品種[1]、施肥[2-5]、栽培密度[6-7]、打頂抹杈[8-9]、土壤含水率[10]、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[11]、調(diào)制技術(shù)、生態(tài)條件[12]等。目前，煙堿含量的測(cè)定方法采用光譜法[13-15]、色譜法[16-18]、兩譜聯(lián)用法[19]等。煙堿含量測(cè)定方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。本文采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行煙葉中煙堿的定量測(cè)定，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，為煙葉煙堿含量測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

氦氣(純度≥99.999%)；煙堿(標(biāo)樣，純度95.0%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái))；正十七烷標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo)，純度99.4%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái))；煙葉樣品(由黔西南州七舍煙葉站提供)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C；DENVER 電子天平(感量0.1/0.01 mg)；SB-100T 超聲波振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 萃取溶液配制

配制0.05%(g/mL)正十七烷的正己烷溶液1 000 mL。

1.2.2 煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度為1.892 mg/mL，分別準(zhǔn)確吸取煙堿標(biāo)準(zhǔn)液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 于25 mL 棕色容量瓶中，用1.2.1的萃取溶液定容至刻度，得到煙堿濃度分別為37.84，75.68，113.50，151.20，189.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2.3 色譜條件

色譜條件如表1所示。

表1 色譜條件

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.2.3的色譜條件，分別測(cè)定不同濃度煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)煙堿溶液的濃度，縱坐標(biāo)為煙堿峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值。

1.2.5 樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量2 g煙葉3份，精密稱(chēng)定，分別放入100 mL錐形瓶中，然后分別加入水20 mL，萃取溶液40 mL和氫氧化鈉溶液10 mL，超聲萃取30 min，靜置后取上層有機(jī)相用于分析測(cè)定。

1.2.6 精密度測(cè)定

取151.2 μg/mL的煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，用樣品的煙堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察儀器精密度。

1.2.7 加標(biāo)回收率測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定所建方法的回收率。首先，準(zhǔn)確稱(chēng)取煙葉樣品10份(煙堿含量已知)，分別置于100 mL錐形瓶中，再分別準(zhǔn)確加入1 mg/mL煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，1.5 mL各3份。按1.2.5方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)樣品煙堿含量、加入量和測(cè)得量，計(jì)算煙堿的加標(biāo)回收率。

1.2.8 穩(wěn)定性測(cè)定

將同一煙葉樣品溶液在室溫下，存放0，6，12，24 h 后在相同條件下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差衡量其穩(wěn)定性。

1.2.9 樣品含量計(jì)算

樣品中煙堿的含量以mg/g 計(jì)，結(jié)果以平均值表示(測(cè)定3次)。

2 結(jié)果分析

2.1 選擇離子的選取

將煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物的混合溶液按1.2.3中測(cè)定條件進(jìn)行分析，采用選擇離子掃描(SIM)方式，質(zhì)量掃描范圍33～550 amu。內(nèi)標(biāo)物(正十七烷)保留時(shí)間為9.64 min，煙堿保留時(shí)間為12.68 min。選取相對(duì)豐度較高的2個(gè)離子為定量選擇離子，定量離子m/z分別為84.10和133.00。樣品的煙堿含量在選擇離子掃描(SIM)方式下，煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖如圖1所示，樣品提取液的總離子流色譜圖如圖2所示。

由圖1和圖2可知，煙堿與內(nèi)標(biāo)物色譜峰分離良好，譜圖純凈，可以進(jìn)行定量分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸曲線方程為y= 0.001x+ 0.001 6，相關(guān)系數(shù)r= 0.999，如圖3所示。說(shuō)明煙堿在37.84～189.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.3 精密度測(cè)定結(jié)果

將同一煙葉樣品溶液在相同條件下平行測(cè)定6次。樣品的煙堿含量測(cè)定結(jié)果分別為23.41，23.41，23.89，23.10，23.71，23.46，23.61 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 1.16%，表明該方法的精密度高，能夠滿(mǎn)足測(cè)定要求。

2.4 穩(wěn)定性

將同一煙葉樣品溶液在室溫下分別保存0，6，12，24 h，然后在相同條件下進(jìn)行測(cè)定，煙堿含量結(jié)果為23.46，23.81，23.40，23.12 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.20 %，表明待測(cè)樣品液在24 h 內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.5 加標(biāo)回收率

在1.2.3色譜條件下進(jìn)樣計(jì)算結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可知，其回收率在96%～103%的范圍內(nèi)，證明測(cè)量方法準(zhǔn)確度高。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果

2.6 樣品煙堿含量測(cè)定結(jié)果

樣品煙堿含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 煙葉樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線聯(lián)用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定煙葉中煙堿含量的方法。與文獻(xiàn)中的方法相比，該方法能有效地避免復(fù)雜樣品中其他非目標(biāo)物質(zhì)的干擾，無(wú)干擾色譜峰。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，適用于煙葉中煙堿的含量測(cè)定。