劉苗，劉瑞波，劉巴蒂，錢鷹

（東南大學化學化工學院,南京 211189）

在光激發(fā)下，光敏染料通過光控能量轉(zhuǎn)移的方式產(chǎn)生具有細胞毒性的單線態(tài)氧，誘導腫瘤細胞凋亡、壞死，實現(xiàn)腫瘤細胞的光動力治療（PDT）.光動力治療具有選擇性好、耐藥性強、暗毒性低以及可協(xié)同治療等優(yōu)勢，在惡性腫瘤治療領(lǐng)域中具有重要的應用潛力［1～6］.近紅外雙光子激發(fā)的光敏劑具有生物損傷小、組織深部光透性強、自身熒光干擾弱和時空選擇性高的優(yōu)勢，能有效地殺死腫瘤細胞［7，8］.因此，設(shè)計和合成雙光子光敏染料具有重要意義.另一方面，光敏染料產(chǎn)生的單線態(tài)氧存在壽命短（＜5 s）、擴散范圍?。ǎ?00 nm）的不足，只能在光敏劑富集的區(qū)域發(fā)生作用［9～12］.由此可知，具有細胞器靶向的光敏劑可以提高對惡性腫瘤治療的靶向性.溶酶體內(nèi)含多種水解酶，是細胞的消化中心.快速增長、分裂的腫瘤細胞為了可以應對微環(huán)境的改變和保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，需要溶酶體的降解功能，破壞溶酶體膜結(jié)構(gòu)會導致腫瘤細胞凋亡或壞死.因此，引入多個溶酶體靶向基團可以實現(xiàn)精準的光動力治療［13～16］.目前文獻報道的光敏劑主要包括卟啉類、花菁類、萘酰亞胺類、羅丹明類以及氟硼二吡咯類［17～22］.然而，這些光敏劑存在發(fā)射波長較短、單線態(tài)氧效率低及腫瘤靶向性差等缺陷.綜上所述，設(shè)計和合成具有溶酶體靶向的近紅外光敏劑用于雙光子熒光成像及光動力治療具有重要的意義和價值.

本課題組［23～29］近期報道了一系列化合物用于光動力治療研究.以氟硼二吡咯（BODIPY）為母核，設(shè)計合成了基于自旋軌道電荷轉(zhuǎn)移-系間竄越（SOCT-ISC）機制的光敏劑［23，24］；報道了噻吩-氟硼二吡咯雙光子光敏染料，用于雙光子熒光成像及腫瘤細胞的光動力治療［25］；首次將熒光蛋白生色團類似物應用于光動力治療，設(shè)計合成了吩噻嗪-熒光蛋白類雙光子光敏染料［26～28］；報道了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的七甲川菁光敏劑，用于A549細胞的光動力治療和雙光子熒光成像［29］.在前期工作基礎(chǔ)上，結(jié)合BODIPY染料具有摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好以及熒光發(fā)射峰窄等優(yōu)點［30～33］，本文設(shè)計合成了一個具有溶酶體靶向的近紅外光敏劑IMBDP-Lys，用于雙光子熒光成像及光動力治療（Scheme 1）.該光敏劑是通過“一鍋法”和Knoevenagel縮合反應引入吲哚嗎啉功能團到BODIPY的8-位和3-位構(gòu)筑而成.3-位和8-位的2個嗎啉基團提高了光敏劑對溶酶體的靶向能力和生物相容性，共軛連接使光敏劑吸收與發(fā)射波長均發(fā)生紅移.測定了光敏劑IMBDP-Lys在二氯甲烷溶液中的紫外-可見吸收光譜、熒光量子產(chǎn)率及單線態(tài)氧量子產(chǎn)率.此外，將該光敏劑成功應用于斑馬魚的雙光子熒光成像和A549腫瘤細胞的光動力治療研究.

Scheme 1 Structure of photosensitizer IMBDP-Lys and its application in two-photon fluorescence imaging and photodynamic therapy

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

吲哚-3-甲醛，分析純，阿拉丁試劑有限公司；N-（2-氯乙基）嗎啉鹽酸鹽，分析純，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；N-碘代丁二酰亞胺（NIS），分析純，Sigma Aldrich公司；細胞毒性實驗用溴化噻唑藍四氮唑（MTT），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、無水乙醇和甲苯，分析純，國藥集團化學試劑有限公司.

AvanceⅢHD 600 Hz型核磁共振光譜儀（NMR），瑞士Bruker公司；Ultraflex II型（MALDI-TOF）高分辨質(zhì)譜儀（HRMS），瑞士Bruker公司；UV-3600型紫外-可見光譜儀（UV-Vis），日本島津公司；FluoroMax-4型熒光光譜儀，日本崛場公司；Fluoviewfv 3000型共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），奧林巴斯公司；FV1000MPE型雙光子熒光顯微鏡，奧林巴斯公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 光敏劑IMBDP-Lys的合成參照文獻［34～36］方法制備中間體BDP和IMBDP，光敏劑IMBDPLys的合成路線如Scheme 2所示.

Scheme 2 Synthetic route of photosensitizer IMBDP-Lys

在N2氣保護下，將218.4 mg（0.3 mmol）IMBDP和92.9 mg（0.4 mmol）1-（2-嗎啉代乙基）1H-吲哚-3-甲醛溶于20.0 mL甲苯中，攪拌均勻后，加入20.0 μL催化劑哌啶和20.0 μL冰醋酸.將上述混合液在110℃下攪拌反應，利用薄層色譜跟蹤反應進程.反應結(jié)束后，用二氯甲烷和水洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)抽干多余溶劑，用閃式柱層析純化得到IMBDP-Lys深綠色固體，產(chǎn)率為38%.1HNMR（600 MHz，CDCl3），δ：8.52（d，J=7.5 Hz，2H），8.23（d，J=7.8 Hz，2H），7.88（d，J=16.6 Hz，2H），7.56（s，2H），7.32（d，J=7.3 Hz，2H），7.17（t，J=7.5 Hz，1H），7.05（s，1H），4.37～4.30（m，4H），3.73（s，8H），2.81（s，6H），2.55（s，12H），1.49（s，3H）.C42H45BF2I2N6O2HRMS實測值（理論值），m/z：969.1859（969.1827）［M+H］+.

1.2.2 光動力治療實驗 實驗中采用1640不完全培養(yǎng)基和10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細胞，于37℃，5%（體積分數(shù)）CO2的孵育箱中培養(yǎng).通過MTT實驗測定了細胞的暗毒性和光毒性.用含有光敏劑的新鮮培養(yǎng)基分別孵育A549細胞和斑馬魚1 h，可得到斑馬魚的雙光子熒光成像和細胞成像.將商用溶酶體綠色染料Lyso-Tracker Green與含有光敏劑的A549細胞共孵育30 min，溶酶體共定位成像在共聚焦激光掃描顯微鏡下進行（Lyso-Tracker Green：λex=488 nm，λem=515～545 nm）.采用活性氧熒光探針DCFH-DA測試了細胞內(nèi)活性氧含量［CLSM，2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）：λex=488 nm，λem=488～520 nm］.在黑暗環(huán)境中用吖啶橙（AO）和溴化乙錠（EB）染料進行AO/EB雙染色實驗，研究了腫瘤細胞的凋亡過程.采用細胞遷移實驗探究了光敏劑抑制腫瘤細胞的能力.

2 結(jié)果與討論

2.1 雙吲哚嗎啉取代的近紅外光敏劑IMBDP-Lys的設(shè)計與理論計算

實驗中選擇BODIPY染料作為熒光母核，通過“一鍋法”、Knoevenagel縮合反應引入吲哚嗎啉基團到BODIPY染料的3-位和8-位，構(gòu)筑了一種雙吲哚嗎啉取代、紅光發(fā)射的光敏劑IMBDP-Lys.光敏劑3-位，8-位的2個嗎啉基團不僅強化了對溶酶體的靶向能力，還改善了光敏劑的水溶性.此外，吲哚嗎啉基團的共軛連接使光敏劑吸收與發(fā)射波長均發(fā)生紅移，可以應用于雙光子熒光成像和光動力治療.中間體IMBDP和目標產(chǎn)物IMBDP-Lys均采用1HNMR和HRMS進行了表征，所得譜圖見本文支持信息圖S1～圖S5.

雙吲哚嗎啉取代的近紅外光敏染料IMBDP-Lys具有較強的系間竄越（ISC）能力，可顯著提升單線態(tài)氧效率.采用高斯09W理論計算了光敏劑IMBDP-Lys的系間竄越過程.基于DFT/CAM-B3LYP/6-31G（d）/LANL2DZ方法優(yōu)化了光敏劑IMBDP-Lys染料的幾何構(gòu)型，基于TD-DFT/CAM-B3LYP/TD-DFT//B3LYP/6-31g（d）/LANL2DZ方法，用TD-DFT預測了光敏劑IMBDP-Lys的單重態(tài)和三重態(tài)激發(fā)能，計算結(jié)果列于本文支持信息表S1.由圖1可見，IMBDP-Lys光敏劑的S0→S1和S0→T1躍遷過程由最高占據(jù)分子軌道（HOMO）→最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）主導，T2態(tài)由HOMO-1→LUMO主導.光敏劑S1態(tài)的能量值（2.52 eV）遠高于T1態(tài)（1.07 eV），而略高于T2態(tài)（2.40 eV），由此可知，S1與T2態(tài)之間的能量差較?。?.12 eV），可以發(fā)生系間竄越.另一方面，T2態(tài)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換（IC）至T1態(tài)產(chǎn)生的能量值大于三重態(tài)氧（3O2）轉(zhuǎn)化為單重態(tài)氧（1O2）所需的能量值（0.98 eV）.由理論計算結(jié)果預測，雙吲哚嗎啉取代的近紅外光敏染料IMBDP-Lys可通過系間竄越產(chǎn)生單線態(tài)氧.

Fig.1 Energy and frontier molecular orbital diagrams of photosensitizer IMBDP-Lys obtained with TD-DFT/CAM-B3LYP/TD-DFT//B3LYP/6-31g(d)/LANL2DZ level based on the optimized ground state geometries at DFT/CAM-B3LYP/6-31G(d)/LANL2DZ level basis set

2.2 IMBDP-Lys光敏劑在660 nm光作用下的單線態(tài)氧產(chǎn)率

圖2（A）給出光敏劑IMBDP-Lys的紫外-可見光譜和熒光光譜，最大吸收波長為631 nm（摩爾消光系數(shù)為6.8×104L·mol-1·cm-1），發(fā)射波長為684 nm.以吲哚菁綠為參比，熒光量子產(chǎn)率為9.7%.

光敏劑IMBDP-Lys的單線態(tài)氧量子效率用參比法進行測試，以亞甲基藍為參比，1，3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）為單線態(tài)氧捕獲劑.由圖2（B）可見，用660 nm的燈照射9.59 s后，IMBDP-Lys光敏劑能使DPBF的吸光度逐漸降低，經(jīng)計算其單線態(tài)氧效率為48.3%.同時，光敏劑自身主吸收峰處吸光度幾乎保持不變，表明光敏劑有良好的光穩(wěn)定性.由上述結(jié)果可知，光敏劑在660 nm光照下可以產(chǎn)生單線態(tài)氧并且在紅光區(qū)有良好的光穩(wěn)定性.光敏劑IMBDP-Lys在二氯甲烷溶液中紫外吸收波長、發(fā)射波長、摩爾消光系數(shù)以及熒光量子產(chǎn)率和單線態(tài)產(chǎn)率的數(shù)據(jù)見表1.

Fig.2 Absorbance spectrum and fluorescence spectrum of photosensitizer IMBDP-Lys(1×10-5 mol/L)in CH2Cl2(A)and absorbance decrease at 414 nm of DPBF with photosensitizer IMBDP-Lys under 660 nm irradiation(B)

Table 1 UV absorption,emission wavelength,molar absorption coefficient,ΦF and ΦΔof PS IMBDP-Lys

2.3 IMBDP-Lys光敏劑用于雙光子熒光成像

雙光子吸收具有組織穿透性強、生物損傷小、光漂白小及空間選擇性強的特點，可實現(xiàn)深層組織的高分辨熒光成像，為光動力治療提供指導.將斑馬魚胚胎經(jīng)培養(yǎng)液孵育成幼苗，與光敏劑IMBDPLys共孵育1 h后，用900 nm的飛秒激光對光敏劑進行雙光子熒光成像.由圖3可見，斑馬魚的頭部、身體以及尾部呈現(xiàn)清晰明亮的紅色熒光.光敏劑IMBDP-Lys可以在近紅外激光激發(fā)下產(chǎn)生雙光子上轉(zhuǎn)換熒光，在雙光子激發(fā)光動力治療方面具有重要的應用潛力.

Fig.3 Two-photon imaging of the photosensitizer IMBDP-Lys(2 μmol/L)in zebrafish(λex=900 nm)

對光敏劑IMBDP-Lys進行了單光子熒光成像.將A549細胞在含有2 μmol/L光敏劑IMBDP-Lys的培養(yǎng)基中孵育30 min，用CLSM進行成像拍攝.由圖4可見，光敏劑IMBDP-Lys能迅速進入細胞內(nèi)，并呈現(xiàn)出紅色熒光，由此可知光敏劑MBDP-Lys具有良好的生物相容性.

Fig.4 Single-photon imaging of the photosensitizer IMBDP-Lys(2 μmol/L)in A549 cells

光敏劑產(chǎn)生的活性氧存在壽命短、擴散范圍小的不足，具有亞細胞器靶向的光敏劑產(chǎn)生的活性氧有更好的光動力效果.本文引入了2個溶酶體靶向功能團——嗎啉，含有光敏劑IMBDP-Lys的細胞與商用溶酶體染料Lyso-Tracker Green共孵育進行溶酶體共定位成像.由圖5可見，商業(yè)溶酶體染料發(fā)出的綠色熒光和光敏劑IMBDP-Lys展現(xiàn)的紅色熒光重疊效果較好，經(jīng)計算共定位系數(shù)高達0.95.上述結(jié)果表明，光敏劑IMBDP-Lys具有良好的溶酶體共定位能力.

Fig.5 Lysosome co-localization image of photosensitizers IMBDP-Lys(1 μmol/L)and Lyso-Tracker Green(1 μmol/L)

2.4 IMBDP-Lys光敏劑在A549細胞中的光動力治療研究

采用MTT法測定了光敏劑IMBDP-Lys對A549細胞的毒性.由圖6可見，在黑暗環(huán)境中，細胞與光敏劑IMBDP-Lys孵育24 h后細胞存活率超過85%，這表明光敏劑IMBDP-Lys在黑暗中對細胞的生存能力影響較小，具有較低的暗毒性.相反，在光照條件下，細胞存活率顯著降低，且隨著光敏劑IMBDP-Lys濃度和光照時間的增加，細胞存活率不斷下降.在660 nm近紅外光分別照射10和30 min后，A549細胞的最大半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為1.85和0.52 μmol/L.上述結(jié)果表明，光敏劑IMBDP-Lys具有低的暗毒性和高的光毒性.

采用活性氧熒光探針DCFH-DA探究了光敏劑產(chǎn)生活性氧的能力，細胞內(nèi)產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以使無熒光的DCFH轉(zhuǎn)變成有綠色熒光的2’，7’-二氯熒光素（DCF）.由圖7可見，在黑暗條件下，光敏劑IMBDP-Lys與A549細胞孵育24 h，加入DCFH-DA染料后細胞只顯示了光敏劑本身的紅色熒光，由此可知，黑暗條件下光敏劑未產(chǎn)生活性氧.但用660 nm的光照細胞5 min后，細胞內(nèi)出現(xiàn)了綠色熒光，表明光敏劑在光照下可以產(chǎn)生活性氧.類似地，光敏劑IMBDP-Lys在斑馬魚內(nèi)也有上述相同的實驗現(xiàn)象.由此說明近紅外光照下光敏劑IMBDP-Lys在細胞和斑馬魚體內(nèi)均可以產(chǎn)生活性氧.

采用AO和EB進行活/死細胞染色實驗，探究了光敏劑對A549細胞的凋亡過程.AO具有膜通透性，可以使活細胞核DNA和RNA染成綠色，EB僅能透過膜受損的細胞，嵌入核DNA并發(fā)出紅色熒光，因此通過熒光可以區(qū)分細胞的存活狀態(tài).由圖8（A）可見，無光照條件下，Group a細胞顯示出均勻的綠色熒光.在660 nm光照Group b細胞5 min后，Group b細胞發(fā)出的綠色熒光減少，并且EB染料通道出現(xiàn)紅色熒光.上述現(xiàn)象表明，光敏劑在660 nm光照下可以使腫瘤細胞發(fā)生凋亡或壞死.

Fig.6 Cell viability of different concentrations of photosensitizer IMBDP-Lys under 660 nm illumination for 0,10 and 30 min

Fig.7 Imaging of ROS with photosensitizer IMBDP-Lys

Fig.8 Photodynamic therapy with photosensitizers IMBDP-Lys in A549 cell

通過細胞遷移實驗探究了光敏劑對腫瘤細胞的抑制能力.由圖8（B）可見，含有光敏劑IMBDP-Lys（1 μmol/L）的細胞在無光照下其生長不受限制，劃痕逐漸愈合.這表明光敏劑IMBDP-Lys在黑暗條件下對細胞的毒性極低，不會對細胞的生長和增殖產(chǎn)生負面影響.然而，在用660 nm的燈照射細胞5 min后，細胞的遷移被顯著抑制，即使在孵育48 h后遷移也幾乎無變化.由此可知，光敏劑IBDP-Lys在660 nm的光照下能有效抑制腫瘤細胞的遷移.

本文設(shè)計合成了一個雙溶酶體靶向的近紅外光敏劑IMBDP-Lys，該光敏劑具有單線態(tài)氧效率高、生物相容性好及精準靶向溶酶體的性質(zhì)，成功應用于雙光子熒光成像和光動力治療.3-位和8-位的2個嗎啉基團強化了對溶酶體的定位能力，與溶酶體商業(yè)染料共定位系數(shù)為0.95.此外，用900 nm飛秒激光對光敏劑IMBDP-Lys進行了雙光子熒光成像，光敏劑能夠快速進入斑馬魚體內(nèi)并顯示出清晰的紅色熒光.用660 nm光照射光敏劑可以產(chǎn)生單線態(tài)氧誘導A549細胞凋亡，具有良好的模擬光動力治療效果.因此，光敏劑IMBDP-Lys有望為雙光子熒光成像和光動治療打下基礎(chǔ).

3 結(jié) 論

設(shè)計合成了一種雙溶酶體靶向、紅光發(fā)射的光敏染料IMBDP-Lys，應用于雙光子熒光成像和腫瘤細胞中的光動力治療.選擇具有優(yōu)異光物理性質(zhì)的吲哚嗎啉-BODIPY熒光染料作為熒光母核，通過Knoevenagel縮合反應引入吲哚嗎啉基團共軛連接到吲哚-BODIPY染料的3位，構(gòu)筑了一種結(jié)構(gòu)新穎、雙吲哚嗎啉取代的近紅外光敏染料IMBDP-Lys.采用高斯09W軟件計算了光敏劑的S1與T2態(tài)之間的能量差為0.12 eV，可以有效地發(fā)生系間竄越從而提高單線態(tài)氧的效率.此外，光敏劑IMBDP-Lys中3-位和8-位的2個嗎啉基團可以強化對溶酶體的靶向能力，改善光動力治療效果.在二氯甲烷溶液中，光敏劑IMBDP-Lys的最大吸收波長為631 nm，最大發(fā)射波長為684 nm.在660 nm光照射下，以亞甲藍為參比，光敏劑IMBDP-Lys的單線態(tài)氧產(chǎn)率高達48.3%.在體外細胞實驗中，含有2個吲哚嗎啉基團的光敏劑具有良好的細胞相容性和精準的溶酶體靶向性；用900 nm的飛秒激光照射斑馬魚進行雙光子熒光成像，呈現(xiàn)出清晰的紅色熒光.與商業(yè)溶酶體綠色染料Lyso-Tracker Green共孵育顯示紅色熒光與綠色熒光具有良好的重疊，共定位系數(shù)（R）經(jīng)計算為0.95.MTT實驗結(jié)果表明，光敏劑IMBDP-Lys有極低的暗毒性（細胞存活率≥85%）和高的光毒性（IC50=0.52 μmol/L）.在660 nm近紅外光照下，活性氧熒光探針DCFH-DA顯示出綠色熒光，表明光敏劑在近紅外光照下可以產(chǎn)生活性氧.此外，AO/EB細胞染色實驗、細胞遷移實驗結(jié)果表明，光敏劑IMBDP-Lys不僅可以誘導A549細胞凋亡，而且能夠有效抑制腫瘤細胞的遷移.總之，雙吲哚嗎啉取代的近紅外光敏劑IMBDP-Lys可以應用于雙光子熒光成像和光動力治療，是一種非常有應用前景的光敏劑.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220326.