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        缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b的外泌體而調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞活化、遷移和鐵死亡

        2022-10-14 01:36:34劉圣桂宋風(fēng)榮別自東鞏傳芬
        關(guān)鍵詞:復(fù)氧外泌體源性

        劉圣桂 宋風(fēng)榮 別自東 鞏傳芬

        山東醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校附屬費縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,臨沂 253400

        逐漸有研究發(fā)現(xiàn),外泌體等一些細(xì)胞外囊泡能攜帶特異的RNA和蛋白而介導(dǎo)細(xì)胞和組織間的通訊,進(jìn)而參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)事件,例如炎性反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展、凋亡和鐵死亡等細(xì)胞死亡、血管生成和免疫應(yīng)答等,從而有可能成為疾病診斷的早期標(biāo)志物及靶向運載藥物的重要載體[1-2]。近年來,有研究表明,心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞間也能通過外泌體等進(jìn)行信息交換,從而影響對方的生物學(xué)功能[3-4]。例如,心肌細(xì)胞在心肌梗死后能分泌大量的外泌體到血清和細(xì)胞間,從而影響疾病的生理病理過程[5]。目前,關(guān)于外泌體的研究已成為心臟疾病診治的研究熱點,但目前關(guān)于其中的作用機制的研究還不多。已有多項研究表明,各種外泌體中含有豐富的miRNAs,miR-208b就是其中一種[6-7]。miR-208b特異表達(dá)于心臟,且參與心肌肥厚、心肌梗死、心肌缺血、心肌纖維化及心力衰竭等多種心血管疾病的調(diào)控[7-9]。在多種心血管疾病發(fā)生的過程中,心肌組織均會分泌高表達(dá)miR-208b的外泌體,進(jìn)而影響其他細(xì)胞的生理過程,從而影響疾病的進(jìn)展過程[7-8]。但外泌體源性miR-208b是否能影響心肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能,目前研究甚少。另外,鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡模式,是鐵離子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)不斷生成累積而導(dǎo)致的[10]。目前有研究指出,鐵死亡在多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用,且與成纖維細(xì)胞的活化關(guān)系密切[11-12]。但miR-208b是否也參與了鐵死亡的調(diào)控,目前還未有研究報道。本研究通過缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌外泌體,探討外泌體源性miR-208b是否影響心肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能,將為心肌疾病的防治提供新思路和新靶點,同時為外泌體和其來源的miRNAs的臨床應(yīng)用提供更好的指導(dǎo)作用。

        資料與方法

        1、細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型建立

        人心肌細(xì)胞和人心肌成纖維細(xì)胞分別用含5%胎牛血清和雙抗的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基-2進(jìn)行培養(yǎng)。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-208b 抑制劑后培養(yǎng)于缺氧條件(含1%氧氣)12 h,然后復(fù)氧(正常培養(yǎng)條件)培養(yǎng)12 h。

        2、外泌體分離和鑒定

        收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,在3 000×g下離心15 min,然后通過0.22 μm 膜過濾。用ExoQuick-TC 按照說明書進(jìn)行分離外泌體,然后通過JEM-2100透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。同時,裂解外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析,以檢測外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101的表達(dá)。

        3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光定量PCR(RT-qPCR)

        根據(jù)試劑說明書,使用Lipofectamine 2000 分別將50 nmol/L miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics 和 miRNA 陰性對照(NC)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。然后心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧或缺氧/復(fù)氧處理,心肌成纖維細(xì)胞加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體(N-Exo)、缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞來源的外泌體(H/R-Exo)、鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin(10 μmol/L)或Erastin加H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng)。用miRNeasy Mini Kit 試劑盒提取心肌細(xì)胞、外泌體和心肌成纖維細(xì)胞的總RNA,接著用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo(dT)和 random primer(或 miR-208b stem-loop RT primer)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMix 通過 qRT-PCR 測定 RNA 表達(dá)水平。U6 和 GAPDH 被用作 miRNA 和 mRNA 的內(nèi)部對照,相對表達(dá)水平通過 2-ΔΔCt值計算。

        4、外泌體攝取檢測

        在 37 ℃下用2 μl CellTracker CM-DiI 標(biāo)記外泌體1 h,用ExoQuick-TC 沉淀DiI 標(biāo)記的外泌體,然后添加到心肌成纖維細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)12 h。之后,固定并洗滌心肌成纖維細(xì)胞,并加入核染色(DAPI)對細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min。最后,使用熒光顯微鏡觀察心肌成纖維細(xì)胞。

        5、Western blot實驗

        使用含蛋白酶抑制劑的RIPA buffer 從心肌細(xì)胞、外泌體和心肌成纖維細(xì)胞中提取總蛋白。使用8% SDS-PAGE分離等量的每個蛋白樣品,并將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用CD63、TSG101、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、谷胱甘肽過氧化物酶 4(glutathione peroxidase 4,GPX4)或β-肌動蛋白(β-actin)一抗和辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。最后,使用BeyoECL Plus顯示印跡信號。

        6、細(xì)胞存活力檢測

        心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后,使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細(xì)胞活力。每孔中加入10μl CCK-8 溶液,用酶標(biāo)儀測量450 nm的吸光度。

        7、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

        收集心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清液,用human pro-collagen Ⅰ alpha 1 DuoSet ELISA kit 和 human collagenⅢELISA kit 根據(jù)試劑盒說明書分別檢測Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的濃度。

        8、Transwell檢測細(xì)胞遷移

        將200 μl 無血清培養(yǎng)基(含2×105個心肌成纖維細(xì)胞)接種到上室,下室加入含2.5%胎牛血清的培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱8 h后,遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,接著用結(jié)晶紫染色10 min。最后,選擇5 個隨機區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),評估細(xì)胞遷移水平。

        9、脂質(zhì)過氧化和Fe2+檢測

        使用ROS assay kit 分析細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,先將心肌成纖維細(xì)胞與 10 μmol/L ROS 熒光探針 DCFH-DA 于 37 ℃避光孵育20 min,然后用熒光分光度計在488 nm 激發(fā)波長和525 nm 發(fā)射波長下檢測熒光強度。按照試劑盒說明書所示,使用lipid peroxidation MDA assay kit 檢測心肌成纖維細(xì)胞裂解物中丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量。用iron assay kit檢測心肌成纖維細(xì)胞中Fe2+水平。

        10、統(tǒng)計學(xué)方法

        使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間的顯著性分析使用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1、缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b 的外泌體

        對心肌細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn),其能分泌外泌體(圖1A),且外泌體顯著表達(dá)相關(guān)的標(biāo)志物(圖1B)。缺氧和缺氧/復(fù)氧(H/R)均能促進(jìn)miR-208b 在心肌細(xì)胞中的表達(dá),且H/R 的促表達(dá)效果更顯著(圖1C)。檢測心肌細(xì)胞所分泌外泌體中miR-208b 的表達(dá)也發(fā)現(xiàn),缺氧和H/R 顯著促進(jìn)外泌體中miR-208b 的表達(dá),且 H/R-Exo 中 miR-208b 的表達(dá)水平更高(圖1D)。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑后,外泌體中miR-208b的表達(dá)顯著減少(圖1C、D)。這表明,缺氧能促進(jìn)miR-208b 在心肌細(xì)胞和其分泌外泌體中的表達(dá),且H/R 進(jìn)一步增強上述效果。不過心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行缺氧和H/R處理時,miR-208b 在細(xì)胞中的表達(dá)變化不明顯(圖1E),表明缺氧和H/R 不影響miR-208b 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。

        圖1 缺氧/復(fù)氧促進(jìn)心肌細(xì)胞和其分泌外泌體高表達(dá)miR-208b。A:電鏡觀察心肌細(xì)胞所分泌外泌體;B:Western blot檢測外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101的表達(dá)水平;C~D:心肌細(xì)胞培養(yǎng)于缺氧條件(Hypoxia,含1%氧氣)12 h后,復(fù)氧(Reoxygenation,正常培養(yǎng)條件)培養(yǎng)12 h,或轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再進(jìn)行H 或H/R 處理,接著用熒光定量PCR 檢測心肌細(xì)胞(C)和其分泌外泌體(D)中miR-208b的表達(dá)水平,NC為miRNA 陰性對照;E:心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行缺氧或缺氧/復(fù)氧處理,然后用熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-208b的表達(dá)水平

        2、H/R-Exo 通過miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活和遷移

        將H/R-Exo 加入到心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時,可明顯觀察到心肌成纖維細(xì)胞攝入外泌體(圖2A)。同時,H/R-Exo 顯著增加miR-208b 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá),而N-Exo無此作用(圖2B)。H/R-Exo 明顯促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活力,而抑制miR-208b 表達(dá)時,H/R-Exo 促細(xì)胞存活的作用顯著被減少,且N-Exo 無法促進(jìn)細(xì)胞存活力(圖2C)。同時對細(xì)胞遷移的檢測表明,H/R-Exo 顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移,miR-208b 的抑制物能減弱上述外泌體的促遷移作用;而N-Exo對細(xì)胞的遷移無影響(圖2D~E)。這表明H/R心肌細(xì)胞所分泌外泌體通過高表達(dá)的miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活和遷移。

        圖2 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體(H/R-Exo)通過miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞存活和遷移。A:H/R-Exo 用熒光染料DiI 標(biāo)記后加入到心肌成纖維細(xì)胞(CFs)中進(jìn)行共培養(yǎng),然后熒光顯微鏡觀察CFs 攝取外泌體,DAPI 為核染色;B~D:CFs 分別加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體(N-Exo)和H/R-Exo,或轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑后再加入H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng);B:熒光定量PCR 檢測miR-208b的表達(dá)水平;C:細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細(xì)胞存活力,D~E:Transwell檢測細(xì)胞遷移

        3、H/R-Exo 通過miR-208b 增強心肌成纖維細(xì)胞的活化

        另 外 ,H/R-Exo 顯 著 增 強 α -SMA、Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ的mRNA 表達(dá)水平(圖3A~C),并促進(jìn)α-SMA的蛋白表達(dá)(圖3D),增加Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的分泌水平(圖3E~F),而N-Exo 無此作用。轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑的心肌成纖維細(xì)胞與H/R-Exo 共培養(yǎng)時,H/R-Exo 促進(jìn)α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)的作用顯著被減弱(圖3)。因此,H/R-Exo 通過攜帶高水平的miR-208b 而促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的活化。

        圖3 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體(H/R-Exo)通過miR-208b 增強心肌成纖維細(xì)胞(CFs)的活化。CFs 分別加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體(N-Exo)和H/R-Exo,或轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再加入H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng)。熒光定量PCR 檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(A)、Collagen Ⅰ(B)和Collagen Ⅲ(C)的表達(dá),Western blot 檢測α-SMA 的蛋白表達(dá)水平(D),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測Collagen Ⅰ(E)和Collagen Ⅲ(F)的分泌水平

        4、H/R-Exo 通過miR-208b 增加心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡水平

        最新的研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡,一種新的細(xì)胞死亡方式,參與了成纖維細(xì)胞的活化過程[12]。因此,研究繼續(xù)探討H/R-Exo 所含miR-208b 是否與鐵死亡相關(guān)。用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 處理心肌成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn),鐵死亡的主要指標(biāo)ROS、MDA 和Fe2+的含量顯著增加(圖4A~C),而調(diào)控鐵死亡進(jìn)程的關(guān)鍵因子GPX4的表達(dá)明顯下調(diào)(圖4D~E),表明細(xì)胞的鐵死亡水平增加。同時加入Erastin 和H/R-Exo 時,ROS、MDA 和 Fe2+的累積進(jìn)一步增強(圖 4A~C),而GPX4 的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(圖4D~E)。心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再加入Erastin 和H/R-Exo 時,上述鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的變化水平顯著低于Erastin 和H/R-Exo(Erastin+H/R-Exo)處理組(圖4)。另外,miR-208b mimics也能增加ROS、MDA 和Fe2+的含量(圖4),表明miR-208b 能促進(jìn)鐵死亡發(fā)生。因此,H/R-Exo 可通過攜帶高水平的miR-208b而增強心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程。

        圖4 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體(H/R-Exo)通過miR-208b 誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)的鐵死亡發(fā)生。CFs 分別加入鐵死亡誘導(dǎo)劑 Erastin、Erastin 和 H/R-Exo、Erastin 加 H/R-Exo 和miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics。用活性氧(ROS)熒光探針 DCFH-DA 檢測ROS 生成量(A),用脂質(zhì)過氧化丙二醛(MDA)檢測試劑盒檢測MDA 的產(chǎn)生(B),用鐵測定試劑盒測量Fe2+的含量(C),熒光定量PCR和Western blot檢測谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的表達(dá)水平(D、E)

        討 論

        多種心臟病均會導(dǎo)致心肌纖維化,而纖維化的出現(xiàn)是決定心血管病預(yù)后的重要因素,會導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥[13]。因此,了解清楚心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的機制將有助于心臟疾病的預(yù)防治療,并可能找到合適的治療靶點。

        逐漸有研究發(fā)現(xiàn),在心肌疾病發(fā)生的過程中,不同細(xì)胞間可以通過外泌體等進(jìn)行信息交流,從而影響疾病的進(jìn)展過程[14]。例如,Luo 等[15]研究發(fā)現(xiàn),缺血后處理可上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞所分泌外泌體/微囊泡中miR-423-3p 的表達(dá),進(jìn)而這些外泌體/微囊泡通過miR-423-3p 靶向下游效應(yīng)器RAP2C而在缺血再灌注損傷急性期發(fā)揮心臟保護作用。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)會誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞釋放外泌體,進(jìn)而通過激活A(yù)kt 和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路而增加心肌細(xì)胞中Ang Ⅱ的產(chǎn)生及其受體的表達(dá),從而加劇Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[16]。本研究則發(fā)現(xiàn),缺氧和缺氧/復(fù)氧均可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b 的外泌體。Wang 等[17]研究表明,缺氧會導(dǎo)致 H9c2 細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208a/b 的細(xì)胞外小泡,而這些細(xì)胞外小泡會通過miR-208a/b 而靶向抑制 RNA 結(jié)合蛋白抖動(QKI)的表達(dá),從而加劇缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),H/R-Exo 明顯促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活力和遷移,增強α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá),而miR-208b 的抑制物能顯著減弱上述外泌體對心肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響作用。因此,心肌細(xì)胞外泌體源性miR-208b在心肌疾病中具有重要意義。

        本研究同時還發(fā)現(xiàn),用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 處理心肌成纖維細(xì)胞時,H/R-Exo 能進(jìn)一步增強鐵死亡主要指標(biāo)ROS、MDA 和Fe2+的累積,抑制鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控因子GPX4 的表達(dá);miR-208b 的抑制物能明顯減弱Erastin 和H/R-Exo 對鐵死亡的影響作用,并且miR-208b mimics 具有誘發(fā)鐵死亡發(fā)生的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn),H/R-Exo 能通過miR-208a/b而影響心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡。而逐漸有研究表明,鐵死亡能影響成纖維細(xì)胞的活化[18-19]。例如,長鏈非編碼RNA-ZFAS1 在博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)處理的HFL1 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可通過miR-150-5p/SLC38A1軸而誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生,從而促進(jìn)TGF-β1 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化、炎癥和脂質(zhì)過氧化,增強BLM 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和肺纖維化進(jìn)展[18]。而在缺血再灌注(I/R)大鼠模型和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞模型中,miR-375-3p 通過抑制GPX4 的表達(dá)而加速心肌細(xì)胞的鐵死亡,從而促進(jìn)纖維化;miR-375-3p拮抗劑(或抑制劑)和Fer-1 促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的抗氧化能力,減少GPX4介導(dǎo)的鐵死亡過程,減輕I/R誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞活化[19]。另外,MLK3主要調(diào)節(jié)鐵死亡導(dǎo)致的慢性心力衰竭晚期心肌纖維化和JNK/p53 信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,從而促進(jìn)壓力超負(fù)荷引起的不良心肌纖維化[20]。上述研究均表明,鐵死亡能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化,表明鐵死亡是纖維化疾病的一個重要誘因。

        綜合上述,H/R-Exo 能通過高表達(dá)的miR-208b 而調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞的存活力、遷移、活化和鐵死亡等生物學(xué)功能,表明外泌體源性miR-208b 具有重要的功能,可能是心肌疾病密切相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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