田平平， 鄒琴， 盧雨微， 郭兵， 石明雋**

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全學(xué)院 護(hù)理學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025)

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的、長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能與mRNA 3′UTR區(qū)的靶序列特異性結(jié)合，抑制靶蛋白的翻譯[1-2]，miRNA異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3-4]。有研究報(bào)道，在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎組織中miR-27a表達(dá)增加，敲低miR-27a可以抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，也可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相關(guān)促纖維化基因的表達(dá)[5]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, Sfrp1)是分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族(secreted frizzled-related protein family, Sfrps)成員之一，亦是miR-27a最主要的靶基因[6-7]，過表達(dá)miR-27a可以抑制Sfrp1蛋白的表達(dá)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，Sfrp1誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型[10]，EMT是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變并執(zhí)行間質(zhì)細(xì)胞功能的一種形態(tài)學(xué)變化，也是促進(jìn)腎纖維化進(jìn)程的重要原因之一。因此，本研究擬從體外觀察過表達(dá)和敲低miR-27a后對(duì)Sfrp1及EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響，探索在高糖環(huán)境下的miR-27a能否通過調(diào)控Sfrp1的表達(dá)影響EMT的發(fā)生，為DN的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來源 大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞，購自美國菌種保藏中心，ATCC)。

1.1.2主要試劑 Trizol Regent(美國ambion公司)，Sfrp1和β-actin引物(上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司)，Revert Aid TM Firststrand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司)，2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)，miR-27a、U6引物和Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer試劑盒(廣州銳博生物公司)，pMIR-REPORT-Sfrp1野生型和突變型質(zhì)粒(上海毅樂生物科技有限公司)，抗col-Ⅳ抗體(美國Sigma公司)，抗β-actin抗體(武漢普美克生物技術(shù)有限公司)，抗α-SMA抗體(武漢proteintech公司)，抗Sfrp1抗體、抗E-cadherin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibico公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 NRK-52E細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清、5%CO237 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至70%時(shí)分為正常糖(NG組，5.5 mmol/L)和高糖(HG組，30 mmol/L)兩組，48 h后收取蛋白和RNA備用；高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞長至70%時(shí)分成miR-27amimics陰性對(duì)照組(miR-27amnc組)、miR-27amimics組(miR-27am組)、miR-27ainhibitor陰性對(duì)照組(miR-27ainc組)、miR-27ainhibitor組(miR-27ai組)，轉(zhuǎn)染4～6 h后用新鮮高糖培養(yǎng)基(30 mmol/L)替換原培養(yǎng)基，48 h后收取蛋白和RNA備用。

1.2.2Western blot法檢測Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá) 按照蛋白提取試劑盒說明書提取NRK-52E細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，待溴芬蘭跑至分離膠時(shí)，調(diào)電泳儀為120 V、電泳約60 min后，將其轉(zhuǎn)至預(yù)先準(zhǔn)備好的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，一抗孵育，濃度分別為β-actin(1 ∶4 000)、Sfrp1(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶300)、α-SMA(1 ∶300)、col-Ⅳ(1 ∶1 000)；4 ℃孵育12 h；次日，TBST洗膜；二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL 液顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描檢測 PVDF 膜上的目的蛋白灰度，檢測 PVDF 膜上的目的蛋白，利用Image Lab 5.1 圖像分析軟件進(jìn)行分析并統(tǒng)計(jì)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcriptionre realtime fluorescence quantitative,RT-qPCR )檢測miR-27a及Sfrp1 mRNA的表達(dá) Trizol法提取NRK-52E細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，應(yīng)用Bio-rad熒光定量 PCR儀檢測miR-27a及Sfrp1 mRNA的表達(dá)。miR-27a、U6引物由廣州銳博生物公司合成。β-actin、Sfrp1引物由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司合成。mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔct方法分析。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) TargetScan 生物信息軟件預(yù)測miR-27a和Sfrp1mRNA的3′UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，并由上海毅樂生物科技有限公司設(shè)計(jì)Sfrp1野生型和突變型質(zhì)粒，見圖1，分別命名為pMIR-REPORT-Sfrp1野生型(wt Sfrp1-3′UTR)和pMIR-REPORT-Sfrp1突變型(mtSfrp1-3′UTR)。將NRK-52E細(xì)胞分為野生型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics陰性對(duì)照組(wtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc組)、野生型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics組(wtSfrp1-3′UTR+miR-27am組)、突變型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics陰性對(duì)照組(mtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc組)以及突變型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics組(mtSfrp1-3′UTR+miR-27am)。進(jìn)行轉(zhuǎn)染前1天，將NRK-52E細(xì)胞鋪入24孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到約50%，分別取50 nmolmiR-27amimics(或)miR-27amimics negative control、海腎熒光質(zhì)粒20 ng和Sfrp1野生型(或突變型)質(zhì)粒200 ng 混合于DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染4～6 h后棄去培養(yǎng)基，加入含2%血清的高糖培養(yǎng)基；48 h后按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書操作。PBS液清洗細(xì)胞3次，吸凈24孔板中PBS液，每孔加入PLB 100 μL，于水平搖床上常溫裂解15～20 min；將裂解液吸至1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心3～5 min；吸等量上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中；上機(jī)檢測，分別加入LARⅡ100μL和Stop & Glo? Buffer液100 μL，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測儀檢測螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值進(jìn)行分析。

圖1 pMIR-REPORT-Sfrp1質(zhì)粒圖譜Fig.1 Vector map of pMIR-REPORT-Sfrp1

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NG和HG組細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組miR-27amRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而Sfrp1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；見表1。Western blot結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組Sfrp1、E-cadherin表達(dá)降低(P<0.05)，而col-Ⅳ、α-SMA蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；見圖2、表2。

表1 NG、HG組細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達(dá)Tab.1 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA between NG and HG

圖2 NG、HG組細(xì)胞Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.2 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between NG and HG groups(Western blot)

表2 NG、HG組細(xì)胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)Tab.2 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between NG

2.2 miR-27a 靶向調(diào)控Sfrp1

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與wtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc 相比，wtSfrp1-3′UTR+miR-27am組的相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05)；而當(dāng)Sfrp1基因 3'UTR 的潛在結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后，突變型質(zhì)粒mtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc與mtSfrp1-3′UTR+miR-27am組熒光素酶活性未見明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。提示miR-27a能與Sfrp1 mRNA 3′UTR區(qū)結(jié)合，抑制Sfrp1的表達(dá)。

表3 熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-27a靶向調(diào)控Tab.3 Luciferase reporter gene assayed-regulation of Sfrp1 by

2.3 過表達(dá)miR-27a后NRK-52E細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，與miR-27amnc組相比，miR-27am組miR-27amRNA表達(dá)增高(P<0.05)，Sfrp1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表4。Western blot結(jié)果顯示，與miR-27amnc組比較，miR-27am組Sfrp1、E-cadherin表達(dá)降低(P<0.05)；而col-Ⅳ、α-SMA的蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。見圖3、表5。

表4 miR-27a mnc和miR-27a m組細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達(dá)Tab.4 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA in miR-27a mnc and miR-27a m

圖3 miR-27a mnc和miR-27a m組細(xì)胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.3 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a mnc andmiR-27a m groups(Western blot)

表5 miR-27a mnc和miR-27a m組細(xì)胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)Tab.5 Expression of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳprotein between miR-27a mnc and

2.4 抑制miR-27a后NRK-52E細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，與miR-27ainc組相比，miR-27ai組miR-27a表達(dá)降低(P<0.05)，而Sfrp1表達(dá)增高(P<0.05)。見表6。Western blot結(jié)果顯示，與miR-27ainc組比較，miR-27ai組Sfrp1、E-cadherin表達(dá)增高(P<0.05)；而col-Ⅳ、α-SMA的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4、表7。

表6 miR-27a inc和miR-27a i組細(xì)胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達(dá)Tab.6 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA between miR-27a inc and miR-27a i

圖4 miR-27a inc和miR-27a i組細(xì)胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.4 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a inc andmiR-27a i groups(Western blot)

表7 miR-27a inc和miR-27a i組細(xì)胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(dá)Tab.7 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a inc and

3 討論

DN是糖尿病(diabetes mellitus, DM)所致的一種常見并發(fā)癥，也是引起終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)的常見原因[11]。大量研究表明，腎臟纖維化是導(dǎo)致DN和ESRD的主要病理因素[12-13]。而EMT是促進(jìn)腎纖維化進(jìn)程的重要原因之一[14]。當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)可引起E-cadherin表達(dá)減少或丟失，同時(shí)α-SMA表達(dá)增多。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，肌成纖維細(xì)胞能夠分泌大量ECM并發(fā)生沉積，最終引起腎臟纖維化的發(fā)生。本研究以NRK-52E細(xì)胞為研究對(duì)象，分別給予正常糖和高糖處理48 h，結(jié)果顯示HG組E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA、col-Ⅳ表達(dá)增多，提示高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)腎臟纖維化。

近年研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物中miRNA的調(diào)控作用涉及個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡和腫瘤等。研究證實(shí)，miRNA在腎臟纖維化疾病以及糖尿病腎病中也起著重要作用，miRNA與腎臟疾病的發(fā)生有關(guān)[15-20]，是引起腎臟疾病的一個(gè)新的重要因素，但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a可以通過調(diào)控Sfrp1影響肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中，miR-27a表達(dá)增多，Sfrp1表達(dá)減少。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示，在共同轉(zhuǎn)染了miR-27amimics和Sfrp1野生型質(zhì)粒時(shí)，熒光活性明顯減弱；而在突變型質(zhì)粒組未見明顯變化，證實(shí)miR-27a可以靶向調(diào)控Sfrp1。

Sfrp1是Wnt信號(hào)通路抑制因子之一[21-22]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病大鼠腎組織中，Sfrp1 mRNA和蛋白表達(dá)較正常組大鼠均減少，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路活化并促進(jìn)了腎臟纖維化的發(fā)生[23-24]。也有研究發(fā)現(xiàn)， 在結(jié)直腸癌中，Sfrp1可能通過 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路EMT 的過程[25]。但Sfrp1調(diào)控EMT過程的具體機(jī)制仍不清楚。為進(jìn)一步證實(shí)miR-27a是否通過靶向調(diào)控Sfrp1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT產(chǎn)生影響，本研究分別將高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27amimics和inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-27a后，Sfrp1表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA、col-Ⅳ表達(dá)增多；在miR-27a抑制劑組，Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ表達(dá)水平發(fā)生了相反的變化。說明過表達(dá)miR-27a可以抑制Sfrp1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)高糖狀態(tài)下NRK-52E細(xì)胞EMT的發(fā)生；而抑制miR-27a后，可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了miR-27a可以通過調(diào)控Sfrp1的表達(dá)進(jìn)而影響高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞EMT進(jìn)程。

綜上所述，高糖環(huán)境下，NRK-52E細(xì)胞中miR-27a可以靶向調(diào)控Sfrp1的表達(dá)，影響EMT的發(fā)生，從而參與糖尿病腎病腎臟纖維化的過程。