李哲然， 汪巳卜， 肖婷， 王曉偉， 周雪， 陶玲

(貴州醫(yī)科大學 藥學院； 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心， 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室， 貴州醫(yī)科大學-貴陽市聯(lián)合重點實驗室， 天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

猴頭菇[Hericium erinaceus(Bull.) Pers.]是齒菌科、猴頭菇屬真菌，是我國傳統(tǒng)的貴重藥材，同時又可作為食用珍品、藥用菌等，具有滋補健身、助消化、利五臟的功能。研究表明，猴頭菇含有多肽、多糖、脂肪及蛋白質等活性成分[1-2]，對腫瘤、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及抑郁癥有一定的療效[3-8]，其中猴頭菇多肽在抗氧化和降血脂方面有一定潛力[9-10]，猴頭菇活性成分對中樞神經的神經遞質起抑制作用[11]。脂肪油在自然界中普遍存在，多以脂類為主要成分[12]，其中的部分不飽和脂肪酸具有降血脂、降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗氧化及促進免疫等藥理作用[13-15]。目前，關于猴頭菇的研究多集中在其多肽、多糖等方面，少有學者對猴頭菇脂肪油的含量及化學成分進行研究，其組成和藥理作用也尚不清楚。氣相色譜-質譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)是一種比較成熟的色譜技術，比較適用于熱穩(wěn)定性較好的小分子和易揮發(fā)藥物分析，具有靈敏度高、分析能力比較強等特點[16-18]。本研究為了更好的開發(fā)猴頭菇及相關產品，采用GC-MS法對2個批次的猴頭菇脂肪油化學成分進行鑒定與比較，為猴頭菇脂肪油的質量控制與評價及其制劑的二次開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要實驗儀器 索氏提取器(青島新紀元環(huán)保工程有限公司)，HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，RE-000A型旋轉蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)A3103C型電子分析天平(上海天平儀器技術有限公司)。

1.1.2主要試劑與藥材 石油醚(30～60 ℃)、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、甲醇、鹽酸、氯化鈉等所有化學試劑均為分析純。兩批貴州省黔東南三穗縣猴頭菇藥材(編號S1-S2)，加工方式均為曬干，均儲存在密封、防潮、冷藏的條件下，其中S1的產品標準代號為GB7096，S2的產品標準代號為GB7096。

1.2 研究方法

1.2.1猴頭菇脂肪油的提取[19]稱取猴頭菇藥材20.00 g、粉碎、過4號篩、置于索氏提取器，加入石油醚200 mL浸泡30 min，在80 ℃恒溫水浴條件下，回流4 h、提取3次、合并提取液，通過旋轉蒸發(fā)儀除去石油醚，得到脂肪油提取物，稱取脂肪油質量，計算其提取率：猴頭菇脂肪油的提取率=脂肪油質量(g)/猴頭菇藥材質量(g)×100%。

1.2.2猴頭菇脂肪油的甲酯化[20-21]精密稱取“1.2.1”項下猴頭菇脂肪油0.5 g，以1 ∶40(g/mL)的比例加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液20 mL，于60 ℃水浴中皂化15 min，取出待冷卻；以1 ∶80(g/mL)的比例加入25%鹽酸40 mL，于60 ℃水浴中放置15 min，取出待冷卻；再以1 ∶40(g/mL)的比例加入正己烷20 mL，振蕩；最后以1 ∶40(g/mL)的比例加入飽和氯化鈉溶液20 mL，靜置10 min，取上清液，用無水硫酸鈉干燥，過0.22 μm微孔濾膜，即得甲酯化的猴頭菇脂肪油。

1.2.3GC-MS分析 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫60 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升溫至108 ℃，再以4 ℃/min升溫至160 ℃，保持3 min，再以15 ℃/min升溫至250 ℃，保持15 min，運行時間51 min；汽化室溫度230 ℃，載氣為高純He(99.999%)，載氣流量1.0 mL/min；分流比40 ∶1；溶劑延遲時間3 min。質譜條件：離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 682 V，接口溫度280 ℃，質量范圍29～500 amu。

1.2.4定量定性分析 取脂肪酸甲酯化樣品1 μL經GC-MS分析及鑒定。通過對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist20和Wiley275標準質譜圖，確定了X種揮發(fā)性化學成分，采用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數(shù)。

2 結果

2.1 猴頭菇脂肪油的提取率

按“1.2.1”項下公式計算，結果顯示2個批次的猴頭菇脂肪油的含量存在較大差異，提取率分別為6.38%、4.27%。

2.2 猴頭菇脂肪油的總離子流色譜結果

取“1.2.2”項下經甲酯化的猴頭菇脂肪油的上清液，按“1.2.3”試驗條件進行測定，經GC-MS全掃描模式測得猴頭菇脂肪油甲酯的總離子流色譜結果見圖1。

圖1 不同批次猴頭菇脂肪油甲酯的總離子流色譜圖Fig.1 total ion chromatograms of fatty oil methyl ester from different batches of Hericium erinaceus

2.3 猴頭菇脂肪油的化學成分分析

根據(jù)GC-MS得到的質譜信息，對總離子流色譜圖中的各峰經質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist20和Wiley275標準質譜圖，確定了43種化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數(shù)(表1)。S1鑒定出25種，相對百分含量為98.581%；S2鑒定出38種，相對百分含量為98.432%；這43個成分中酯類20種、烷類6種、羧酸類8種、烯類3種、酚類3種、酰胺類3種。在2批不同猴頭菇脂肪油中均檢測出大量羧酸類化合物，而僅在S1中檢測出醇類化合物。由表1可知，2個批次猴頭菇脂肪油中共有成分有20種，在20個共有成分中百分含量>10%的成分為正十六酸(S1為13.464%，S2為18.934%)、油酸(S1為30.796%、22.422%)及10E，12Z-十八碳二烯酸(S1為11.535%、S2為21.193%)。

表1 兩個批次猴頭菇脂肪油成分及相對含量Tab.1 Composition and relative content of fatty oil of Hericium erinaceus in different batches

續(xù)表

3 討論

猴頭菇作為藥食兩用的高等真菌，其含有多種營養(yǎng)成分、維生素和微量元素，且有很好的藥效作用，近年來得到廣泛應用。但對猴頭菇的研究主要集中在其多肽、多糖類等，而對脂肪油的報道是非常少見的。本研究采用索氏提取法提取猴頭菇脂肪油，并測定其提取率，以及對猴頭菇脂肪油的成分進行檢測。從2個批次的猴頭菇脂肪油中共鑒定出43種成分，這43個成分中酯類20種、烷類6種、羧酸類8種、烯類3種、酚類3種、酰胺類3種，其中批次1鑒定出25種、批次2鑒定出38種。提示在不同批次的猴頭菇中提取的脂肪油成分不盡相同。同時還發(fā)現(xiàn)，2個批次猴頭菇脂肪油中共有的20種成分中，百分含量>10%的成分為正十六酸(S1：13.464%，S2：18.934%)、油酸(S1：30.796%，S2：22.422%)、10E，12Z-十八碳二烯酸(S1：11.535%，S2：21.193%)，提示共有成分的含量也有所不同。這可能與猴頭菇脂肪油的含量會因為儲存時間與條件的影響從而出現(xiàn)損失[22]，也可能與猴頭菇的脂肪油受取材的部位和采集地的氣候、曬干的溫度及時間的影響有關[23]。

綜上所述，本研究采用GC-MS法對2個批次的猴頭菇脂肪油化學成分進行鑒定與比較，發(fā)現(xiàn)在不同批次的猴頭菇中提取的脂肪油成分不盡相同，而且共有成分的含量也有所不同。為猴頭菇脂肪油的質量控制與評價及其制劑的二次開發(fā)提供試驗依據(jù)。