趙硯馳， 李化， 李丹， 孔鵬， 張乙進， 吳潔玲， 莫大雙， 舒莉萍*

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 免疫學教研室, 細胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 貴州省再生醫(yī)學重點實驗室, 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004； 2.中國醫(yī)學科學院 成體干細胞轉(zhuǎn)化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)是一種內(nèi)源性細胞因子、于1989年被發(fā)現(xiàn)，因其能夠抑制輔助性T細胞1(Th1 cell)的激活并影響促炎性細胞因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)及白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)]的活化，被稱為抗炎性細胞因子，在體液免疫與細胞免疫中起著重要作用[1-5]。IL-10由樹突狀細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)、單核細胞及巨噬細胞等產(chǎn)生，與相應(yīng)受體結(jié)合后，導致非受體酪氨酸激酶1(janus kinase 1，JAK1)活化，激活信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通過旁分泌與自分泌作用于樹突狀細胞與巨噬細胞，抑制Th2細胞發(fā)揮功能，同時影響過敏反應(yīng)的發(fā)生[6-8]。有研究報道，IL-10能激活肥大細胞，并增強T淋巴細胞(T-lymphocyte，T cell)、B淋巴細胞(B-lymphocyte，B cell)和NK細胞的功能[9-11]；還發(fā)現(xiàn)IL-10抑制抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APC)激活從而抑制T細胞發(fā)揮功能，誘導腫瘤免疫逃逸[12]；IL-10還可以直接或間接激活NK細胞，增強對腫瘤的殺傷作用[13]，因此IL-10在腫瘤免疫中有著雙向調(diào)節(jié)作用，IL-10的功能及機制研究也受到越來越多的關(guān)注。IL-10在妊娠中維持胚胎正常發(fā)育同樣起著重要作用[14]，有研究報道在正常妊娠過程中，滋養(yǎng)層細胞會分泌IL-10抑制淋巴細胞的增殖，進而使得滋養(yǎng)層細胞免受淋巴細胞的殺傷[15]；抑制IL-10的分泌，將會促進Th1細胞的增高，抑制Th2細胞的分泌，最終成為導致胚胎停止發(fā)育的重要原因之一[16]。既往IL-10相關(guān)研究已在小鼠、兔子等動物模型中進行了探索[17-18]，但因小鼠和兔子具有飼養(yǎng)成本高昂、繁殖周期較長以及胚胎宮內(nèi)發(fā)育等特點，無法清晰直觀且批量高效地探究IL-10在動物體內(nèi)的變化情況。斑馬魚作為模式動物具有體型小、繁殖能力強、飼養(yǎng)繁殖較容易、體外受精以及所產(chǎn)胚胎透明易于觀察等優(yōu)勢，其基因組又與人類基因高度相似[19-20]；且尚未有報道斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中IL-10的表達情況，因此本研究通過同線性分析斑馬魚與人類及小鼠IL-10基因在染色體中的位置，將斑馬魚與不同物種進行氨基酸序列同源性比較，探究斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中IL-10的表達形式，為IL-10相關(guān)疾病研究提供實驗與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 使用野生型斑馬魚(Tüebingen品系)4～72受精后小時 (hourspost-fertilization，hpf)的胚胎，該品系為實驗室自行繁育[合格證號SYXK(黔)2018-0001]；pCS2+載體(pCS2+vector)載體由本實驗室提供，大腸桿菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受態(tài)細胞(北京天根生化)。

1.1.2主要試劑 2×Taq 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)預混液劑(北京天根生化)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內(nèi)切酶NotⅠ和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、T4DNA連接酶(T4 DNA ligase)及NucAwayTMSpin Columns(美國ThermoFisher)，T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美國Promega)，Anti-Digoxigenin-AP(德國Roche)，原位雜交染色試劑盒BCIP / NBT(美國Vector Lab)，TRIzol Reagent(美國ambion)。

1.1.3主要儀器 分子雜交箱HL-2000(美國UVP)，梯度PCR儀etc811(北京東勝創(chuàng)新生物)，超微量生物檢測儀nanodrop(美國ThermoFisher)，體視顯微鏡SMZ25(日本尼康)。

1.2 實驗方法

1.2.1不同物種IL-10基因同源性分析(synteny analysis)及氨基酸序列同源性分析并繪制系統(tǒng)進化樹 在美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中分別查詢IL-10基因在斑馬魚、人類及小鼠染色體中的位置，與Ensemble數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，分別分析人類、斑馬魚、小鼠、大鼠、家兔、雞、袋鼠、牛、黑猩猩、獼猴、紅鰭鲀以及鰱魚的IL-10氨基酸序列，通過多重序列比對軟件(multiple sequence alignment，DNAMAN)對氨基酸序列相似性進行比對；使用分子進化遺傳分析軟件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)分析系統(tǒng)進化樹，以及Neighbor-joining算法進行評估。

1.2.2斑馬魚及胚胎養(yǎng)殖 野生型斑馬魚養(yǎng)殖在室溫(26±2)℃且12 h/12 h照明的循環(huán)水系統(tǒng)中，使用胚胎培養(yǎng)液(0.06 g/L海鹽、0.5 mg/L亞甲基藍)對斑馬魚胚胎進行培養(yǎng)。

1.2.3斑馬魚總RNA提取及互補脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)合成 分別收集3組72 hpf的斑馬魚胚胎90枚(30枚/組)，使用TRIzol試劑對胚胎樣本進行處理，經(jīng)氯分相后使用異丙醇將RNA沉淀，洗滌并晾干后加入無酶水溶解；將上述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.4地高辛標記的IL-10反義信使RNA(messenger RNA，mRNA)探針制備 根據(jù)斑馬魚IL-10基因序列使用Snap Gene軟件設(shè)計引物：F為CCGGAATTCGGAGACCATTCTGCCAACA(劃線位置表示添加的EcoRⅠ位點及保護堿基序列)，R為ATAGTTTAGCGGCCGCCATTTCACCATATCCCGCT(劃線位置表示添加的NotⅠ 位點及保護堿基序列)。使用EcoRⅠ與NotⅠ將pCS2+載體與擴增所得IL-10片段進行雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩者產(chǎn)物進行連接得到重組質(zhì)粒pCS2+-IL-10，將重組產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定與測序鑒定，鑒定無誤后將重組質(zhì)粒線性化，使用T3轉(zhuǎn)錄體系進行體外轉(zhuǎn)錄后，純化所得反義mRNA探針，置于-80 ℃凍存。

1.2.5斑馬魚多時相整胚原位雜交 分別收集4、6 、9 、12、18、24、48及72 hpf的斑馬魚胚胎75枚(25枚/組、3組)，4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎過夜，使用甲醇梯度脫水于-20 ℃保存；原位雜交第1天時會將其中48和72 hpf的胚胎需用蛋白酶K處理；所有時相胚胎置于分子雜交箱中68 ℃預雜交4 h，加IL-10反義mRNA探針雜交14 h；第2天檸檬酸鈉(saline sodium citrate，SSC)緩沖液洗滌，加anti-DIG-AP(1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；第3天用含Tween-20的馬來酸緩沖液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗滌后加入新鮮配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至陽性雜交信號出現(xiàn)后立即使用含Tween的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline tween，PBST)洗滌終止染色，4%PFA固定；在體視顯微鏡下觀察IL-10的陽性雜交信號。

2 結(jié)果

2.1 不同物種間的同源性分析

同源性分析結(jié)果顯示，IL-10基因位于斑馬魚11號染色體上，其上下游存在5個基因組序列與人類1號染色體、小鼠1號染色體上能找到相對應(yīng)的同源區(qū)(圖1)；人類、斑馬魚、小鼠、獼猴、牛及家兔等12個物種IL-10氨基酸序列相似性比對結(jié)果表明，斑馬魚與人類、小鼠、獼猴、牛和家兔等12個物種的IL-10氨基酸序列相似度較高(圖2)；使用MEGA X繪制12個物種的IL-10系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明在斑馬魚IL-10進化過程中與哺乳類動物具有保守性(圖3)。

圖1 人類、斑馬魚及小鼠染色體中IL-10基因的同源性分析Fig.1 Synteny analysis of IL-10 gene in human, zebrafish, and mouse chromosomes

注：英文字母表示不同氨基酸序列，數(shù)字表示氨基酸序列號，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列，-表示該物種與其余物種對比缺失的氨基酸序列片段。圖2 不同物種中IL-10的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Alignment of IL-10 amino acid sequences from multiple species

注：結(jié)點上方數(shù)字為自展值，表示該進化分支的可信度。圖3 不同物種間IL-10的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IL-10 in multiple species

2.2 pCS2+- IL-10重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

氨芐抗性篩選的pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶雙酶切后，結(jié)果顯示目標條帶正確，并將正確的質(zhì)粒進行測序鑒定，將測序結(jié)果與已知斑馬魚IL-10基因序列比對，結(jié)果保持一致。見圖4和圖5。

注：M為DNA Marker Ⅲ，泳道1為IL-10 RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為 pCS2+- IL-10圖4 pCS2+- IL-10重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ與Not Ⅰ雙酶切產(chǎn)物的電泳鑒定Fig.4 Electrophoresis result of pCS2+-IL-10 recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：紅色方框表示所選取限制性內(nèi)切酶及堿基序列，紅色箭頭表示所選取限制性內(nèi)切酶位點；紅色曲線表示胸腺嘧啶，綠色曲線表示腺嘌呤，藍色曲線表示胞嘧啶，黑色曲線表示鳥嘌呤。圖5 pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒的測序結(jié)果Fig.5 Sequencing result of pCS2+- IL-10 recombinant plasmid

2.3 野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中IL-10基因的表達模式

整胚原位雜交實驗的結(jié)果顯示(圖6)，4～12 hpf時，野生型斑馬魚胚胎未觀察到IL-10陽性雜交信號；18 hpf時，野生型斑馬魚胚胎中后部中間細胞群(intermediate cell mass，ICM)中觀察到IL-10表達；24 hpf時，IL-10在野生型斑馬魚胚胎頭部廣泛表達，在其心臟及卵黃囊背側(cè)表達尤為突出；48和72 hpf時，IL-10集中表達于野生型斑馬魚胚胎頭部區(qū)域，在眼眶、心臟以及頭部背側(cè)表達尤為明顯。

注：黑色箭頭表示IL-10表達最為突出部位。圖6 野生型斑馬魚胚胎發(fā)育不同時間點IL-10基因的表達(整胚原位雜交，×80)Fig.6 Expression of IL-10 during embryonic development of wild-type zebrafish at different time(the whole embryo in situ hybridization, ×80)

3 討論

IL-10作為一種具有生物活性的小分子多肽，在免疫系統(tǒng)以及胚胎發(fā)育中都發(fā)揮重要的作用，可以由巨噬細胞、樹突狀細胞及各種T細胞亞群(Th1、Th2以及Th17)產(chǎn)生，其也能抑制Th1、Th2和Th17型T細胞發(fā)揮功能，存在負反饋調(diào)節(jié)抑制巨噬細胞與樹突狀細胞以及針對T細胞的激活[10,21-23]。有研究報道，妊娠婦女血清中IL-10水平明顯高于正常婦女，并且復發(fā)性自然流產(chǎn)患者血清中IL-10水平低于正常婦女[24]；此外，IL-10在體外也能影響多種造血細胞生長和分化，IL-10缺陷的小鼠生長發(fā)育明顯遲緩于正常小鼠，且伴有貧血以及腸道局部炎癥[25-26]。然而相對系統(tǒng)的在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中探究IL-10的表達情況，目前尚未有報道。

近年來，小鼠、兔子等動物已被廣泛用于建立相關(guān)疾病模型，作為研究相關(guān)基因在疾病中機制與功能的方法，而斑馬魚在基因進化上具有高度保守性，使其逐漸成為一種理想的人類疾病研究的動物模型，同時也是研究遺傳與發(fā)育的理想模型[27-28]。伴隨例如成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)與嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino, MO)等技術(shù)的出現(xiàn)，使得多種斑馬魚疾病模型得以成功建立[29]，例如消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)疾病[30]。本研究通過分析斑馬魚胚胎早期發(fā)育中不同時期IL-10 mRNA的表達情況，有助于在相關(guān)疾病的斑馬魚模型中更好地探索IL-10的功能和作用。

本研究結(jié)果顯示，斑馬魚IL-10氨基酸序列與人類IL-10氨基酸序列相似度較高，提示斑馬魚IL-10與人類IL-10功能相似，并且在進化過程中斑馬魚IL-10具有一定保守性。通過成功構(gòu)建pCS2+-IL-10重組質(zhì)粒，制備地高辛標記的IL-10反義mRNA探針，進而通過全胚胎原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，4～12 hpf時未在斑馬魚胚胎中觀察到IL-10陽性雜交信號，而18 hpf時開始，在斑馬魚胚胎ICM區(qū)域觀察到IL-10陽性雜交信號；24、48及72 hpf時，IL-10表達于頭部區(qū)域，在頭部背側(cè)、心臟、眼眶以及卵黃囊背側(cè)部位表達尤為明顯。由于ICM區(qū)域是斑馬魚胚胎發(fā)育的原始造血發(fā)生重要區(qū)域之一，與哺乳類動物胚胎中的卵黃囊相似，其中含有大量原始造血細胞，而源自于ICM的后部造血島位于尾部腹側(cè)區(qū)，標志著原始造血的結(jié)束，此外與斑馬魚胚胎髓系造血發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在16～30 hpf造血前體細胞中表達，而斑馬魚血液循環(huán)開始于24 hpf[27,30]。因此根據(jù)實驗結(jié)果提示IL-10可能與斑馬魚早期胚胎造血發(fā)育有著密切聯(lián)系，在斑馬魚胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析了斑馬魚IL-10氨基酸序列在進化過程中具有相對保守性，并且通過全胚胎原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)IL-10的表達貫穿斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程，提示IL-10可能在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，為進一步探索IL-10在相關(guān)疾病中的功能與機制研究提供了實驗基礎(chǔ)。