林 容，陳敘靜，趙麗娟，羅麗芬，曾興蓮

（昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 昭通 657000）

微生物是一群體型微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微小生物的總稱，主要包括在自然界中真核細(xì)胞型微生物、原核細(xì)胞型微生物和非細(xì)胞型微生物。自然界中微生物的分布非常廣泛，如在空氣、水和土壤中都存在。由于土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是微生物生長(zhǎng)和繁殖的天然培養(yǎng)基，所以土壤中所含的微生物種類繁多。土壤微生物泛指土壤中一切肉眼看不見(jiàn)或看不清楚的微小生物的總稱，通常意義上包括古菌、細(xì)菌、放線菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物和顯微藻類等[1]。土壤微生物參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程并在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如養(yǎng)分吸收、碳氮循環(huán)、生物防治和生物修復(fù)等，同時(shí)土壤微生物還影響著植物的生長(zhǎng)和群落組成。從整個(gè)生物地球化學(xué)過(guò)程來(lái)說(shuō)，通過(guò)研究微生物的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，可以建立微生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能之間的聯(lián)系。

近年來(lái)，隨著生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展和交叉，如活體熒光技術(shù)、PCR、生物標(biāo)記物（FAME）及分子生物學(xué)技術(shù)、信息技術(shù)等新興技術(shù)和方法在土壤微生物研究中的應(yīng)用，土壤微生物區(qū)系的相關(guān)研究應(yīng)對(duì)全球氣候變化、治理各類環(huán)境污染、維持生態(tài)服務(wù)功能及促進(jìn)土壤持續(xù)利用等方面具有重要意義。保持土壤微生物的多樣性對(duì)于人類農(nóng)業(yè)生產(chǎn)亦具有極其重要意義[2]。

土壤微生物的研究在現(xiàn)在得到迅速發(fā)展，正成為一個(gè)新興的研究熱點(diǎn)。土壤微生物的研究對(duì)于探索自然生命機(jī)制、應(yīng)對(duì)全球氣候變化、治理各類環(huán)境污染、維持生態(tài)服務(wù)功能及促進(jìn)土壤持續(xù)利用等方面具有重要意義[1，3]。首先，土壤微生物影響土壤中的氣體成分，比如微生物通過(guò)呼吸作用，導(dǎo)致土壤中產(chǎn)生大量的CO2、CH4等氣體，這些氣體會(huì)對(duì)土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響；其次，土壤微生物是改良土壤質(zhì)量的關(guān)鍵因素。土壤微生物在土壤的養(yǎng)分和物質(zhì)循環(huán)、形成和發(fā)育、肥力維持與提高的過(guò)程中起著重要的作用[4]，且土壤微生物種類和數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)等不僅能較早地預(yù)測(cè)土壤質(zhì)量的變化，還是土壤健康的決定性因素，利用微生物指標(biāo)指示土壤質(zhì)量也已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一[4]。最后，對(duì)于環(huán)境保護(hù)、耕地改良和荒草地的開(kāi)發(fā)利用都依賴于土壤及其微生物的研究，維護(hù)土壤微生物的種類和穩(wěn)定性已成為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提之一[4]。對(duì)于各種極端環(huán)境，如各種濕地、鹽堿地和板結(jié)地的土壤微生物的研究也受到廣大學(xué)者的重視。另外，研究土壤微生物種類和數(shù)量還為有益菌的開(kāi)發(fā)、利用提供了基礎(chǔ)。

前人的研究進(jìn)展，土壤微生物研究已成為土壤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。丁俊男等[5]在《玉米-大豆輪作對(duì)土壤酶和根系微生物群落多樣性的影響》一文中指出輪作種植體系改善了根系土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成，以及改變了根際土壤微生物群落功能利用能力。吳海燕等[6]保護(hù)性耕作條件下玉米田土壤微生物區(qū)系變化與影響因素分析中提到土壤微生物數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)、土壤全氮和全磷有關(guān)。馮健[7]在對(duì)巨桉人工林地下土壤微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌為其中的優(yōu)勢(shì)種群。孫樹(shù)晴等[8]研究表明土壤微生物區(qū)系組成及生物量影響土壤的肥力及土壤理化性質(zhì)和植被影響土壤中微生物的生長(zhǎng)。來(lái)航線等[9]在幾種微生物對(duì)土壤腐殖質(zhì)形成的作用中證明各種類微生物在土壤腐殖質(zhì)總量的形成中均起到積極作用。很多學(xué)者對(duì)于土壤微生物的研究都比較成熟，并且從多方面進(jìn)行研究，雖然不同地方的土壤受當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境，如溫度、濕度、降雨及受土壤本身因素的影響，但是筆者在盡量減少這些因素干擾所造成的影響，從土壤微生物差異去分析本地區(qū)的天然腐殖土和其他土壤的差異，這對(duì)于本地區(qū)土壤微生物的研究是十分必要的。

另外，腐殖土是森林中表土層樹(shù)木的枯枝殘葉經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)期腐爛發(fā)酵后而形成，腐殖土壤顆粒結(jié)構(gòu)，透氣性能好，適合根系生長(zhǎng)需要，并且具有較好的保水保肥能力，我國(guó)的土地很多出現(xiàn)了板結(jié)營(yíng)養(yǎng)流失，通過(guò)對(duì)天然腐殖土微生物區(qū)系分析可以很好地了解腐殖土中微生物的種類，以便很好地對(duì)土地加以保護(hù)和利用，同時(shí)提供給培養(yǎng)植物、莊家等更好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

從未來(lái)發(fā)展戰(zhàn)略看，我國(guó)土地資源豐富，土壤類型較多，但是有著許多在工業(yè)化進(jìn)程中污染的土地、板結(jié)地及荒草地等有待開(kāi)發(fā)利用。通過(guò)研究不同類型土壤中微生物的種類和數(shù)量的差異，在各種技術(shù)措施的作用下改善土壤微環(huán)境，以期改變土壤的肥力和質(zhì)量，以更好地適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等的需要。因此，對(duì)土壤微生物的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

昭陽(yáng)區(qū)是昭通市轄區(qū)，位于云南省東北部，在云南、四川、貴州三省交界處，東經(jīng)102.52°～105.18°，北緯26.18°～28.10°。海拔267～4 040 m，地處暖帶。氣候?qū)儆诒本暩咴箨懠撅L(fēng)氣候，溫暖濕潤(rùn)。昭陽(yáng)區(qū)全年平均氣溫在11.6 ℃，最冷氣溫出現(xiàn)在1 月，月平均氣溫在1～12 ℃之間；最熱溫度出現(xiàn)在7 月，月平均氣溫在20～27 ℃之間；年降水量735 mm。

1.2 樣地選擇

于2022 年3 月，分別采集昭陽(yáng)區(qū)鳳凰山、昭陽(yáng)區(qū)太平街道玉米地和昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院校園3 個(gè)地方的土壤進(jìn)行微生物的分離和培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集

各樣點(diǎn)采樣方法參考丁俊男[5]的方法。

1.3.2 培養(yǎng)基的配置及滅菌

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基參照第三版周德慶主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》配置、馬丁培養(yǎng)基購(gòu)買成品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)所需材料均采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。

1.3.3 土壤含水量測(cè)定

采用烘干法測(cè)定土壤含水量，3 種土壤樣品各稱取10 g，在干燥箱中經(jīng)過(guò)105 ℃，12 h，冷卻后稱量并計(jì)算含水量。土壤含水量計(jì)算方法：α=（m1-m2）/m2，其中m1為濕土質(zhì)量；m2干土質(zhì)量；α 為含水量。

1.3.4 土壤中微生物的分離

每種土壤樣品混勻后各稱取10 g，依據(jù)孫樹(shù)晴等人方法進(jìn)行分離級(jí)逐級(jí)稀釋，得到1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6稀釋?xiě)腋∫海?×10-1至1×10-6每個(gè)稀釋?xiě)腋∫焊魅?00 ul 懸浮液涂布于平板上。待平板干燥后倒置放于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)稀釋?xiě)腋∫壕O(shè)置3 個(gè)平行組。其中真菌置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)（真菌培養(yǎng)5～7 d），細(xì)菌和放線菌置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)（細(xì)菌培養(yǎng)3～5 d，放線菌培養(yǎng)10～14 d），按稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法分別統(tǒng)計(jì)細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量。根據(jù)微生物形成的菌落形態(tài)，包括大小、形狀、顏色、氣味、透明度、表面光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥及邊緣整齊與否等發(fā)面，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行土壤微生物的分類。并按下列公式計(jì)算出每克土壤含菌數(shù)。

每克干土含菌數(shù)=同一稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種量毫升數(shù)×（1-土壤含水量）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用graghpad 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含水量

對(duì)昭陽(yáng)區(qū)鳳凰山天然腐殖土、昭陽(yáng)區(qū)太平街道玉米地農(nóng)耕土及昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院校園非農(nóng)耕土3 個(gè)地方土壤進(jìn)行土壤含水量測(cè)定，詳見(jiàn)表1。鳳凰山天然腐殖土中土壤的含水量較多，昭陽(yáng)區(qū)太平街道玉米地農(nóng)耕土和昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院校園非農(nóng)耕土含水量相對(duì)較少。

表1 土壤含水量

2.2 各種稀釋度菌懸液涂布于平板后，通過(guò)觀察均取10-3 該梯度進(jìn)行記數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，昭陽(yáng)區(qū)鳳凰山天然腐殖土、昭陽(yáng)區(qū)太平街道玉米地農(nóng)耕土、昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院校園非農(nóng)耕土3 個(gè)地方土壤中的真菌、細(xì)菌與放線菌的數(shù)量和種類是有差異的，詳見(jiàn)表2。

表2 不同土壤微生物區(qū)系

首先從種類上來(lái)說(shuō)，昭陽(yáng)區(qū)鳳凰山天然腐殖土中細(xì)菌、真菌和放線菌的種類比其他2 種土壤的種類顯著增多，其次是太平街道玉米地取的農(nóng)耕土中微生物的種類，而學(xué)校里的非農(nóng)耕土中微生物的種類最少，如圖1 所示。

圖1 天然腐殖土、農(nóng)耕土、非農(nóng)耕土微生物種類

從數(shù)量上來(lái)說(shuō)，鳳凰山天然腐殖土中的細(xì)菌數(shù)量比其他2 種土壤中的細(xì)菌數(shù)量顯著增多，3 種土壤中的放線菌和真菌無(wú)明顯差異，如圖2 所示。另外，對(duì)于同一種土壤來(lái)說(shuō)，其中的細(xì)菌的數(shù)量也是高于真菌和放線菌的數(shù)量的。

圖2 天然腐殖土、農(nóng)耕土、非農(nóng)耕土微生物數(shù)量

3 討論與結(jié)論

昭陽(yáng)區(qū)不同土壤微生物種類和數(shù)量是有差異的，在所研究的3 種不同的土壤中，細(xì)菌的數(shù)量均比放線菌和真菌的數(shù)量多，這個(gè)結(jié)果與其他學(xué)者（謝偉等）的研究結(jié)果一致，并且昭陽(yáng)區(qū)天然腐殖土中的細(xì)菌數(shù)量也比其他2 種土壤多，但是其他2 種土壤在真菌和放線菌在數(shù)量上沒(méi)有明顯差異。從種類上來(lái)說(shuō)，昭陽(yáng)區(qū)的天然腐殖土中微生物的種類要比其他2 種土壤中也要多。

通過(guò)對(duì)于昭陽(yáng)區(qū)天然腐殖土、農(nóng)耕土和非農(nóng)耕土在微生物種類和數(shù)量的比較表明，天然腐殖土中的微生物種類和數(shù)量相對(duì)于其他土壤來(lái)說(shuō)都是比較多的，可能由于所采土的地方森林覆蓋率高，樹(shù)葉的枯枝爛葉在腐爛過(guò)程中提供了細(xì)菌所需的微環(huán)境。另外，天然腐殖土中細(xì)菌數(shù)量多，在土壤中占優(yōu)勢(shì)，真菌和放線菌相對(duì)來(lái)說(shuō)種類和數(shù)量較少，土壤中的有機(jī)物質(zhì)、酸堿度和水分等都更有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，而對(duì)于真菌和放線菌有限制作用。另外在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)農(nóng)耕土和非農(nóng)耕土在微生物種類和數(shù)量上沒(méi)有差異，通過(guò)分析可能由于學(xué)校土壤在校園綠化的過(guò)程中受到樹(shù)木和小草的影響，對(duì)于原來(lái)的土壤微生物微環(huán)境有所改善。同時(shí)也說(shuō)明，植物對(duì)于土壤的微環(huán)境，比如有機(jī)物質(zhì)、微生物種類、肥力和酸堿度等方面的改善有作用。通過(guò)種植植物，可以有效地改善土壤微環(huán)境。所以，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，天然腐殖土微生物確實(shí)和其他土壤有差異，但是本研究?jī)H對(duì)于昭陽(yáng)區(qū)3 種土壤微生物進(jìn)行了初步的分析，各類微生物具體的差異還需進(jìn)一步研究。